Isolering og funktionel karakterisering af human Ventrikulær kardiomyocytter fra Fresh Kirurgiske Prøver

Summary

Aktuel viden om den cellulære grundlag af hjertesygdomme meste afhængig af undersøgelser af dyremodeller. Her beskriver vi og validere en ny metode til at opnå en enkelt levedygtige cardiomyocytter fra små kirurgiske prøver af human ventrikulær myokardiet. Menneskelige ventrikelmyocytter kan bruges til elektrofysiologiske undersøgelser og narkotika testning.

Abstract

Kardiomyocytter fra syge hjerter er udsat for komplekse remodeling processer, der involverer ændringer i cellestruktur, excitation sammentrækning kobling og membran ionstrømme. Disse ændringer vil sandsynligvis være ansvarlige for den øgede arytmogene risiko og de kontraktile ændringer, der fører til systolisk og diastolisk dysfunktion i hjertepatienter. Imidlertid har de fleste oplysninger om de ændringer af myocyt funktion i hjertesygdomme kommer fra dyremodeller.

Her er vi beskrive og validere en protokol til at isolere levedygtige myocytes fra små kirurgiske prøver af ventrikulære myokardiet fra patienter, der gennemgår hjertekirurgi operationer. Protokollen er beskrevet i detaljer. Elektrofysiologiske og intracellulære calcium målinger er rapporteret at demonstrere muligheden for en række encellede målinger i human ventrikulære cardiomyocytter opnået med denne metode.

Protokollen rapporterede hanre kan være nyttige for fremtidige undersøgelser af den cellulære og molekylære grundlag for funktionelle ændringer af det menneskelige hjerte i tilstedeværelsen af ​​forskellige hjertesygdomme. Endvidere kan denne metode anvendes til at identificere nye terapeutiske mål på cellulært niveau og for at teste effektiviteten af ​​nye forbindelser på humane cardiomyocytter med direkte translationel værdi.

Introduction

Dissektion af elektrofysiologiske egenskaber af myokardiet er skredet markant efter udvikling af teknikker for enkelt hjerte-myocyt isolation. Nylige fremskridt i forståelsen af ​​hjerte Excitation Sammentrækning Kobling (EF-kobling) er også blevet gjort muligt ved evnen til at isolere levedygtige enkelt cardiomyocytter, der bevarer alle de fysiologiske egenskaber af intakt væv. Patch clamp metoder rutinemæssigt anvendes til at studere funktionen og farmakologisk modulation af hjerte sarcolemmal ionstrømme. Optagelser af intracellulære calcium dynamik med Ca ^{2 +} følsomme farvestoffer er også regelmæssigt udføres på enkelte hjertemyocytter fra en række sunde og syge modeller, der giver vigtige oplysninger om fysiologi EF-Kobling samt på de patologiske ændringer i intracellulær Ca ^{2 +} homeostase fører til mekanisk svækkelse og øget arytmogene byrde i hjertesygdomme. Information fra disse studier er afgørende for at forstå de elektrofysiologiske og mekaniske virkninger af lægemidler i kliniske omgivelser. Men der er artsspecifikke forskelle i transmembrane strømninger og i EF-Hunstik proteiner, der tegner sig for specifikke træk ved hjertets handling potentiale og hjerte mekanik. Således, mens undersøgelser af myocytter isoleret fra ikke-humane pattedyr har belyst de biofysiske egenskaber og fysiologiske roller specifikke transmembrane ionkanaler og EF-Hunstik proteiner, har de ikke nødvendigvis relevante modeller for humane hjertemyocytter. Isolering af levedygtige myocytes fra menneskelig myokardiet er derfor vigtigt at forstå patofysiologien af ​​hjertesygdomme og validere nye terapeutiske tilgange.

Humant atrialt væv er let tilgængelig som atriale vedhæng ofte kasseres under kirurgiske procedurer. Indledende kvantitative undersøgelser af voksne hjerte-virkningspotentialer menneskelige og ioniske currents ansat enzymatisk isolerede atrielle celler ^1-4. Optagelser af handling potentialer eller strømninger fra isolerede voksne humane ventrikulære celler er efterfølgende blevet rapporteret ^3,5-10. De fleste af disse undersøgelser har anvendt celler fra eksplanterede hjerter og anvendt enten collagenase perfusion af en koronararterie segment eller eksponering af relativt store mængder af udskåret væv collagenase til opnåelse af isolerede celler. Disse undersøgelser have en detaljeret karakterisering af et antal transmembrane ionstrømme fra humane ventrikulære kardiomyocytter fra sunde hjerter og fra patienter med terminal hjertesvigt. Optagelser af L-typen ^{Ca2 +} strøm (I _Ca-L) ^5-7, transient udadgående kaliumstrøm _(I) ^8, aktiv ensretter kalium (I _κ1) ^8, de forskellige komponenter af forsinkede ensretter kalium (I _κ ) ⁹ er blevet rapporteret. Forskud og raffinering afisolation procedure ^10, gav en klar karakterisering af den ioniske grundlag af den øgede arrhythmogene potentiale i terminal hjertesvigt, omfattende virkningspotentiale forlængelse ^11, forsinket efter depolariseringer ¹² og øget sjov strøm ^13, der fører til diastolisk depolarisering og præmature beats.

Voksen hjertemyocytter normalt isoleres fra små dyr ved retrograd perfusion af hele hjertet med forskellige enzymblandinger, en teknik, der producerer høje udbytter af Ca ^{2 +-tolerante} celler ^14. Isolering af hjertemyocytter fra fragmenter af væv i sig selv er mindre vellykket sandsynligvis på grund af den begrænsede adgang af enzymer til individuelle myocytter sammenlignes med den, der opnås ved perfusion af koronararterier. På grund af den meget begrænsede tilgængelighed af ubrugte donorhjerter, den eneste praktiske måde at opnå normale humane ventrikulære celler på en regelmæssig basis er ved enzymatisk digestion af de ofte meget små væv fragmenter skåret under elektive kirurgiske procedurer. Den eneste sygdomsmodel menneske, som er blevet grundigt karakteriseret på celleniveau er terminal hjertesvigt på grund af adgang til transplanterede hjerter. Forekommer imidlertid terminal hjertesvigt hos et mindretal af patienterne og ofte indebærer en fælles vej af alvorlig ombygning af myokardieceller, hvilket er relativt uafhængig af den underliggende årsag ^15. Evnen til at vurdere funktionen af ​​enlige cardiomyocytes fra patienter på et tidligere ikke undlade stadium af sygdommen er afgørende at forstå den specifikke patofysiologi forskellige nedarvede eller erhvervede tilstande. Hypertrofisk kardiomyopati (HCM) er et sigende eksempel. HCM er en almindelig (1/500 individer) arvelig hjertesygdom karakteriseret ved hjertehypertrofi, øget arytmogene risiko-og kontraktile ændringer på grund af udstrømning tarmkanalen obstruktion og diastolisk dysfunktion ^16. Kardiomyocytter fra HCM hjerter undergo en kompleks remodeling processer, der involverer ændringer i cellestruktur (hypertrofi, myofibrillar uorden) og EF-Kobling ^17. Imidlertid har de fleste oplysninger om myocyt dysfunktion i HCM kommer fra transgene dyremodeller. Da kun et mindretal af HCM patienter udvikler mod terminal hjertesvigt og kræver hjertetransplantation, er meget sjældent tilgængelige for celleisolering med standardmetoder HCM hjerter. Men mindst 30% af HCM patienter udvikler obstruktive symptomer på grund af massiv septal hypertrofi ændre udstrømning tarmkanalen blodgennemstrømning under systole (HCM) ^18. Den mest effektive tilgængelige terapeutisk mulighed for lindring af obstruktion i HCM er kirurgisk septal myectomy: I løbet af denne kirurgiske procedure, er en variabel størrelse del af øvre septum fjernes ved trans aorta tilgang. Denne del af hypertrophied septum er derfor tilgængelig for celle isolation fra frisk væv.

En fremgangsmåde til isolering af humant ventricular myocytter fra enkelte, små transvenøse endomyokardiel biopsipræparater tidligere har været udviklet og udgivet ^19. Vi implementerede en metode til at isolere enkelte septumdefekter myocytes fra ventrikulære myocardium prøver fra patienter, der gennemgår hjertekirurgi, herunder patienter med HCM gennemgår septal myectomy og patienter, der gennemgår ventil udskiftning procedurer. Ud over en detaljeret beskrivelse af isolation protokollen, repræsentativ elektrofysiologiske og Ca ^{2 +} fluorescens målinger præsenteres, dokumentere levedygtigheden af de isolerede humane ventrikelmyocytter og gennemførligheden af patch clamp og intracellulære Ca ^{2 +} studier.

Protocol

De eksperimentelle protokoller om humant væv blev godkendt af den etiske komité i Careggi University Hospital (2006 / 0.024.713; fornyet maj 2009). Hver patient gav skriftligt informeret samtykke. 1. Løsninger og udstyr Forberedelse Løsninger er beskrevet i tabel 1. Et forenklet rutediagram over celleisolering procedure findes i figur 1.. Opløsni…

Representative Results

Den ovenfor beskrevne metode blev anvendt til at karakterisere de funktionelle abnormiteter i cardiomyocytes isoleret fra interventricular septum af patienter med hypertrofisk kardiomyopati (HCM), som gennemgik myectomy drift, sammenlignet med ikke svigtende ikke hypertrofisk kirurgiske patienter 21. Resultaterne i dette afsnit stammer fra dette arbejde 21 og er her vist som et eksempel på, hvordan denne teknik kan bruges til at karakterisere ændringer af myocardial celle funktion i hjerte sygdom…

Discussion

Vi har beskrevet og valideret en metode til at isolere levedygtige myocytes fra kirurgiske prøver af human ventrikulær myokardiet. Begyndende fra tidligere beskrevne protokoller, der var blevet anvendt til at isolerede celler fra atrielle kirurgiske prøver, en teknik til at muliggøre separation af enkelte levedygtige myocytter fra syge ventrikulære myocardium blev udviklet og finjusteret. Tidlige rapporter viste, at isolation af enkelte cardiomyocytter fra bidder af atrial og ventrikulær væv selektivt værdiforri…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods