Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Summary

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Abstract

Hartspiercellen van zieke harten zijn onderworpen aan complexe verbouwing processen waarbij veranderingen in de celstructuur, excitatie contractie koppeling en membraan ion stromingen. Deze veranderingen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het verhoogde risico aritmogene en contractiele wijzigingen waardoor systolische en diastolische disfunctie bij hartpatiënten zijn. Echter, de meeste informatie over de wijzigingen van myocyte functie in hartziekten is afkomstig van diermodellen.

Hier beschrijven we en valideren van een protocol om levensvatbare myocytes isoleren van kleine chirurgische monsters van ventriculaire myocardium van patiënten die een hartoperatie operaties. Het protocol wordt beschreven. Elektrofysiologische en intracellulair calcium metingen worden gerapporteerd aan de haalbaarheid van een enkele cel metingen in humane ventriculaire cardiomyocyten verkregen met deze werkwijze tonen.

Het protocol meldde hijre kan nuttig zijn voor toekomstige onderzoeken van de cellulaire en moleculaire basis van functionele veranderingen van het menselijke hart in de aanwezigheid van verschillende hartziekten zijn. Verder kan deze methode worden gebruikt om nieuwe therapeutische targets op cellulair niveau te identificeren en de effectiviteit van nieuwe verbindingen te testen op menselijke cardiomyocyten, directe translationele waarde.

Introduction

Dissectie van de elektrofysiologische eigenschappen van het myocard heeft na de ontwikkeling van technieken voor enkele hartspiercel isolatie aanzienlijk gevorderd. Recente ontwikkelingen in het begrijpen van cardiale Excitatie contractiekoppeling (EG-koppeling) zijn ook mogelijk gemaakt door het vermogen isoleren levensvatbare enkele cardiomyocyten dat alle fysiologische eigenschappen van het intacte weefsel behouden. Patch clamp methoden worden routinematig gebruikt om de functie en farmacologische modulatie van cardiale sarcolemmale ionstromen bestuderen. Opnamen van intracellulair calcium dynamiek ^{Ca2 +} gevoelige kleurstoffen worden regelmatig uitgevoerd in enige cardiale myocyten uit verschillende gezonde en zieke modellen, waarbij het ​​belangrijke gegevens over de fysiologie van EG-koppeling en op de pathologische veranderingen van intracellulaire ^{Ca2 +} homeostase leidt tot mechanische stoornissen en verhoogde aritmogeen lasten op hartziekten. Informatie van deze studies is cruciaal voor het begrijpen van de elektrofysiologische en mechanische effecten van geneesmiddelen in de klinische setting. Er zijn soortspecifieke verschillen in de transmembraan stromen en de EG-koppeling eiwitten die verantwoordelijk zijn voor specifieke kenmerken van cardiale actiepotentiaal en cardiale mechanica. Dus, terwijl studies van myocytes geïsoleerd van niet-menselijke zoogdieren de biofysische eigenschappen en fysiologische rol van specifieke transmembraan ionkanalen en EG-Koppeling eiwitten hebben opgehelderd, zij niet noodzakelijkerwijs relevante modellen van menselijke hartspiercellen. Isolatie van levensvatbare myocytes van menselijke hartspier is daarom essentieel om volledig te begrijpen van de pathofysiologie van hart-en vaatziekten en valideren van nieuwe therapeutische benaderingen.

Menselijke atriaal weefsel beschikbaar atriale aanhangsels vaak tijdens chirurgische procedures worden verwijderd. Initiële kwantitatieve studies van volwassen menselijke cardiale actiepotentialen en ionische currents werkzaam enzymatisch geïsoleerde atriale cellen ^1-4. Opnames van actiepotentialen of stromen van geïsoleerde menselijke ventriculaire cellen volwassen zijn vervolgens gerapporteerd ^3,5-10. De meeste van deze studies gebruikte cellen verkregen uit geëxplanteerde harten en gebruikt hetzij collagenase perfusie van een kransslagader segment of blootstelling van relatief grote hoeveelheden weggesneden weefsel collagenase geïsoleerde cellen te verkrijgen. Deze studies kon een gedetailleerde karakterisering van een aantal transmembraan ionstromen van humane ventriculaire cardiomyocyten van gezonde hart en patiënten met terminale hartfalen. Opnamen van L-type ^{Ca2 +} (I _Ca-L) ^5-7, voorbijgaande buitenwaartse kaliumstroom _(I) ⁸ binnenwaartse kaliumstroom (I _κ1) ^8, de verschillende componenten van vertraagde gelijkrichter kalium (I _κ ) ⁹ gemeld. Voorschotten en raffinage vande isolatie procedure ^10, kon een duidelijk karakterisering van de ionische basis van de toegenomen arrhythmogenic potentieel in terminal hartfalen, bestaande uit actiepotentiaal verlenging ^11, vertraagd na depolarisaties ¹² en verhoogde grappige huidige ¹³ leidt tot diastolische depolarisatie en premature slagen.

Volwassen hartspiercellen gewoonlijk geïsoleerd uit kleine dieren door retrograde perfusie van het gehele hart met verschillende enzymmengsel een techniek die hoge opbrengsten van Ca ^{2 +-tolerante} cellen ¹⁴ produceert. Isolatie van cardiale myocyten van fragmenten van weefsel inherent minder succesvol waarschijnlijk vanwege de beperkte toegankelijkheid van enzymen individuele myocyten vergeleken met die bereikt door perfusie van kransslagaders. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van ongebruikte donorharten, de enige praktische manier om normale humane ventriculaire cellen te verkrijgen regelmatig is door enzymatische spijn van de vaak zeer kleine weefselfragmenten weggesneden tijdens electieve chirurgische procedures. De enige menselijke ziektemodel die grondig gekarakteriseerd op celniveau terminaal hartfalen, vanwege de toegankelijkheid van getransplanteerde harten. Echter, terminal hartfalen optreedt in een minderheid van de patiënten vaak gaat om een gemeenschappelijke route van ernstige herinrichting van myocardiale cellen, die relatief onafhankelijk van de onderliggende oorzaak ^15. De mogelijkheid om de functie van afzonderlijke hartspiercellen uit beoordelen patiënten eerder niet falende stadium van de ziekte is cruciaal voor de specifieke pathofysiologie van verschillende erfelijke of verworven aandoeningen begrijpen. Hypertrofische cardiomyopathie (HCM) is een sprekend voorbeeld. HCM is een gemeenschappelijke (1/500 personen) erfelijke cardiale aandoening gekenmerkt door hypertrofie van het hart, verhoogde arrhythmogenic risico en contractiele veranderingen als gevolg van obstructie van de uitstroom en diastolische dysfunctie ^16. Hartspiercellen van HCM harten undergo een complexe verbouwing processen die veranderingen in celstructuur (hypertrofie, myofibrillar wanorde) en EG-Koppeling ^17. Echter, de meeste informatie van myocyte disfunctie bij HCM is afkomstig van transgene diermodellen. Aangezien slechts een minderheid van de HCM patiënten evolueert in de richting van terminal hartfalen en vereist harttransplantatie, HCM harten zijn zeer zelden beschikbaar voor celisolatie met standaard methoden. Echter, ten minste 30% van de HCM patiënten ontwikkelen obstructieve symptomen als gevolg van massale septum hypertrofie veranderen uitstroombaan bloedstroom tijdens systole (HCM) ^18. De meest effectieve beschikbare therapeutische optie voor de verlichting van de obstructie in HCM is chirurgische septum myectomy: tijdens deze chirurgische procedure wordt een variabele grootte deel van de bovenste septum verwijderd door trans aorta aanpak. Dit gedeelte van hypertrofe septum is dus beschikbaar voor celisolatie uit de verse weefsel.

Werkwijze voor de isolatie van menselijke ventricular myocytes van enkele, kleine transvenous endomyocardiale biopsiespecimens eerder is ontwikkeld en gepubliceerd ^19. We hebben een methode om enkele septum myocytes isoleren van ventriculaire myocard monsters van patiënten die hartchirurgie ondergaan, waaronder patiënten met HCM ondergaan septum myectomy en patiënten die een klepvervanging procedures. Naast een gedetailleerde beschrijving van de isolatieprotocol representatief elektrofysiologische en ^{Ca2 +} fluorescentiemetingen worden, dat de levensvatbaarheid van de geïsoleerde humane ventriculaire myocyten en de haalbaarheid van patch clamp en intracellulaire ^{Ca2 +} onderzoeken.

Protocol

De experimentele protocollen op menselijk weefsel werden goedgekeurd door de ethische commissie van Careggi Universitair Ziekenhuis (2006/0024713; vernieuwd mei 2009). Elke patiënt gaf schriftelijk toestemming.

1. Solutions en apparatuur voorbereiding

Oplossingen worden beschreven in Tabel 1. Een vereenvoudigd stroomschema van de cel isolatieprocedure wordt in Figuur 1.

Oplossing		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
Reagens (mM)	KH 2 PO 4	50
	MgSO4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	adenosine	5
	glucose	140	10	20	10		10	10
	mannitol	100
	taurine	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl2		</ Td>		1.2	5
	KH 2 PO 4		0.6	30			0.6	0.6
	Na 2 HPO 4		0.6				0.6	0.6
	NaHCO3		12				12	12
	KHCO3		10				10	10
	Na-pyruvaat		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5 </ Td>
	barnsteenzuur			5
	EGTA			0.5
	K 2-ATP			2
	pyrodruivenzuur			5
	creatine			5
	KMES					115
Enzymen (U / ml)	Collagenase Type V						250 </ Td>	250
	Protease Type XXIV						4
pH		7.4 KOH	7,3 NaOH	7.1 KOH	7.35 NaOH	7.2 KOH	7,3 NaOH	7,3 NaOH

. Tabel 1 Solutions gebruikt voor het verzamelen van monsters, celisolatie en functionele karakterisering van myocytes CP = cardioplegische oplossing.; DB = dissociatie buffer; KB = Kraft-Bruhe oplossing; TB = Tyrode buffer; PS = pipet oplossing; EB1 = enzymbuffer 1; EB2 = enzymbuffer 2.

1. Bereid cardioplegische (CP) oplossing. CP oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 week.
2. Bereid Ca ^{2 +} gratis dissociatie buffer (DB). Deze oplossing moet worden gebruikt binnen de dag.
3. Bereid Kraft-Bruhe (KB)-oplossing. KB oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 week.
4. Bereid Ca ^{2 +} gratis Tyrode buffer (TB). Deze oplossing moet worden gebruikt binnen de dag.
5. Filter alle oplossingen met behulp van spuit filters voor gebruik.
6. Bereid de spijsvertering (figuur 2), een schrapend bakken van twee tegenover elkaar liggende borstels van siliconenelastomeer, waarvan geroteerd door een elektromotor. De spijsvertering apparaat wordt op maat gemaakt. Details over de vertering apparaat zijn in figuur 8; beelden van de inrichting in fig. 2C en 2D. Was de weefselkamer met 70% ethanol en water.

2. Verzamelen en verwerken van myocard Monsters

1. Giet 40 ml cardiplegic (CP) oplossing in een 50 ml buis en op te slaan in ijs voor specimen vervoer van het operatieve kamer naar de celisolatie lab.
2. Verzamel de ventriculaire myocard exemplaar uit de operatieve kamer onmiddellijk na excisie, wassen met ijskoudCP-oplossing en bewaar het in de buis. Gebruik endocardiale exemplaren uitgesneden uit de bovenste inter ventriculaire septum tijdens open hart operatie, gewicht> 100 mg.
3. Snel het monster over te brengen naar het lab gebied; binnen 10 min van specimen excisie beginnen specimen verwerking.
4. Terwijl het model in ijskoud CP buffer, verwijder voorzichtig de endocardiale fibrotische laag met behulp van fijne schaar onder een stereomicroscoop; daarna, snijd het myocardium in kleine stukjes (2-3 mm lang). Afhankelijk van weefsel steekproefgrootte, snijd een totaal bedrag van ventriculaire myocard tussen 100 mg en 1 g per isolement.
5. Na voltooiing van weefsel hakken, breng het myocard brokken in de vertering apparaat, met schone ijskoude CP oplossing. Vermijd vullen het gehele volume tussen de twee silicium borstels (3-4 ml) met myocardiale brokken, met niet meer dan 1 g totaal weefsel.

3. Wassen en Spijsvertering van myocard Brokken

1. Achteruiter de brokken worden overgebracht naar het schrapen kamer van de spijsvertering apparaat, wijzigt de CP buffer in de kamer met koud Ca ^{2 +-vrij} dissociatie buffer (DB).
2. Plaats de vertering inrichting in een thermostatisch bad, zodat de kamer tot in contact met het verwarmde water in het bad (figuur 1). Zet het bad tot 37,5 ° C en zet hem aan, om langzaam de temperatuur van het weefsel kamer. Zet de motor van de vertering inrichting, waarin de rotatiesnelheid 1 omwenteling / seconde.
3. Voer 3 wasbeurten met DB, het veranderen van de oplossing in de kamer met schone DB om de 8 minuten. Het DB wordt verwarmd (37 ° C) en zuurstof verzadigd voordat je in contact met het myocard brokken.
4. Bereid enzymbuffer 1 (EB1) door het toevoegen van 250 U / ml Collagenase Type V en 4 U / ml protease Type XXIV DB oplossing. Bereid enzymbuffer 2 (EB2) door het toevoegen van 250 E / ml Collagenase Type V DB oplossing. Warming-up (37 ° C) en oxygenate EB1 en EB2.
5. Voer twee cycli van 12 minuten digestie in de roterende inrichting digestie met 100% zuurstof EB1 (bij 37 ° C). Bij elke cyclus gebruikt ~ 3 ml EB1. Verwijder de oplossing met een pipet aspiratie en gooi deze na elke cyclus.
6. Bereid 6 15 ml buizen voor celinzameling en ~ 80 ml koude (4 ° C) oplossing KB elueren de buffers.
7. Voer een eerste 15 minuten digestie-cyclus met 3 ml 100% zuurstof EB2 bij 37 ° C. Na de digestie-cyclus, verzamel de oplossing die de eerste gedissocieerd myocyten in een 15 ml buis en de celsuspensie verdund met 12 ml koude oplossing KB. Bewaar de buis plat bij kamertemperatuur.
8. Verdun de resterende EB2 oplossing met een gelijke hoeveelheid DB om de concentratie van collagenase V halveren de volgende digestie cycli.
9. Voer andere 5 12 minuten digestie cycli met 3 ml EB2 bij 37 ° C; na elk van hen verzamelen van myocyte met buffer in een 15 ml conische buis enverdunnen met 12 ml KB oplossing. Bewaar de 6 cel met buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

4. Cell Resuspension en Ca ^{2 +} Revalidatie

1. Voeg 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA) tot 20 ml ^{Ca2 +-vrije} Tyrode buffer (TB). Filtreer de oplossing.
2. Centrifugeer de zes myocyte met conische buizen bij 100 xg gedurende 5 minuten te myocytes te vestigen dwingen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in elke buis met een variabele hoeveelheid (1-3 ml, afhankelijk van de opbrengst) van BSA met TB bij kamertemperatuur.
3. Verhoog geleidelijk Ca ^{2 +-concentratie} in de cel met buffer door het toevoegen van kleine hoeveelheden van 100 mmol / L _CaCl2 oplossing. In de eerste en tweede stap ^{Ca2 +-concentratie} wordt verhoogd tot 50 umol / L en 100 umol / L respectievelijk. De volgende ^{Ca2 +} toevoeging stappen worden uitgevoerd om de 5 min en de concentratie wordt verhoogd met 100 umol / L bij elke stap to een eindconcentratie van 0,9 mmol / L.
4. Beoordelen van de opbrengst van de isolatie procedure. Transfer 0,5 ml myocyte bevattende oplossing op het glas onderste kamer van een microscoop. Evalueer 15 microscoopvelden 10x objectiefvergroting en berekent het percentage gezonde myocyten (bijvoorbeeld staafvormige cellen met heldere strepen en geen significante insluitsels, figuur 2). De verwachte opbrengst is rond de 20%.

5. Functionele Evaluatie van Geïsoleerde Cardiomyocytes.

Het volgende protocol is een voorbeeld van de menselijke cardiomyocyte functieonderzoek, waaronder simultane opnames van actiepotentialen en intracellulaire Ca ^{2 +} fluxen.

1. Bereid pipetoplossing (PS) voor patch clamp experimenten in geperforeerde patch configuratie. De oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C maximaal 3 maanden.
2. Voeg 1,8 mmol / L _CaCl2 om Ca ^{2 +-vrij} Tyrode buffer (TB). Use deze oplossing voor superfusie van hartspiercellen tijdens patch clamp / fluorescentie experimenten.
3. Breng 1 ml celsuspensie om een ​​1,5 ml buis en voeg 10 micromol / l Fluoforte en 10 ul Powerload Concentrate. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Daarna stelt u de buis in verticale positie en laat de cel te regelen voor 5 min; resuspendeer de cellen in Ca ^{2 +} met TB.
4. Breng 0,25 ml celsuspensie met een kleine (0,5 ml), geïsoleerde microscoop gemonteerd opname kamer, superfused door zwaartekracht met een verwarmd microperfusor systeem met een stroomsnelheid van 0,3 ml / min (temperatuur: 37 ± 0,5 ° C).
5. Met een micropipet trekker, bereid patch clamp pipetten met een tip diameter van 3 tot 5 urn en een weerstand van 3-4,5 M gevuld met PS.
6. Voeg amfotericine B een partij PS (250 ug / ml) en gebruiken om de elektroden te vullen.
7. Selecteer een staafvormige cel met duidelijke strepen, verstoken van insluitsels, form de giga afdichting en wacht 5 tot 10 minuten, totdat de toegang weerstand lager is dan 20 MQ.
8. Ontlokken actiepotentialen in stroomtang modus met behulp van korte pulsen (<3 msec) bij verschillende frequenties van de stimulatie (0,2 Hz, 0,5 Hz en 1 Hz, 1 min bij elke frequentie). Tijdens de opname fase, zet helder veld verlichting bij 492 ± 3 nm en detecteren Fluoforte fluorescentie bij 505-520 nm. Verwerven fluorescentie en membraanpotentiaal signalen met behulp Digidata 1440A en PClamp 10,0 software. Herhaal de opname sequentie meerdere malen als nodig; echter, houdt de totale opnametijd minder dan 15 min voor elke cel.

Representative Results

De hierboven beschreven werkwijze werd gebruikt om de functionele abnormaliteiten cardiomyocyten geïsoleerd uit het septum patiënten met hypertrofische cardiomyopathie (HCM) die myectomy operatie ondergingen kenmerken, vergeleken met niet niet niet hypertrofische chirurgische patiënten ^21. De resultaten in dit deel zijn afgeleid van dat werk ²¹ en worden hier getoond als een voorbeeld van hoe deze techniek gebruikt kan worden om de veranderingen in myocardiale celfunctie cardiale aandoeningen karakteriseren.

Een representatief monster van een chirurgische patiënt met HCM wordt getoond in Figuur 2A. Chirurgische monsters waren zeer variabel qua grootte en dikte van de endocardiale vezelachtige strepen. De hoeveelheid hartspierweefsel dat we voor elke isolatiewerkwijze van HCM monsters bedroeg ongeveer 1 g. In plaats daarvan, de hoeveelheid weefsel die voor controlemonsters was kleiner (100-500 mg.), Door Lower beschikbaarheid weefsel. De opbrengst was significant hoger wanneer controlemonsters werden bewerkt met betrekking tot HCM, waarschijnlijk omdat de relatieve hoeveelheid levensvatbare myocardiale cellen in het weefsel in HCM myocardium wordt verminderd en endomyocardiale fibrose verhoogd ^22. Uit deze waarnemingen concludeerde we dat de vereiste hoeveelheid weefsel levensvatbare cellen te verkrijgen kan variabel zijn, afhankelijk van de afwezigheid of aanwezigheid van myocardiale ziekte.

Monsters werden gesneden in kleine stukjes zoals getoond in figuur 2B. Daarna werden de stukken overgebracht in de kamer van de spijsvertering (figuur 2C) en gebruikt voor cel isolatie zoals hierboven (figuur 2D) beschreven. Representatieve microfoto van een celsuspensie verkregen met de beschreven cel isolatieprocedure van een septum monster wordt getoond in figuren 3A en 3B; vergrote beelden van enkele ventriculaire cardiomyocytes zijn weergegeven in Figuren 3C-3F. Cardiomyocyten van HCM monsters werden gebruikt voor gelijktijdige opnames van actiepotentialen en intracellulaire ^{Ca2 +} variaties zoals beschreven in het hoofdstuk protocol. Representatieve gelijktijdige sporen geeft membraanvoltage (boven) en intracellulaire ^{Ca2 +} (onder) tijdens stimulatie op 3 verschillende frequenties zijn getoond in Figuur 4: deze sporen werden geregistreerd van een cardiomyocyten geïsoleerd uit een monster HCM.

Resultaten van patch clamp studies toonden aan dat de duur van de actiepotentiaal (APD) opgenomen op verschillende frequenties van de stimulatie duidelijk werd verlengd in hartspiercellen van patiënten met HCM (HCM cardiomyocyten) in vergelijking met controles (figuur 5A en 5B). Om het onderhoud van fysiologische reacties in geïsoleerde myocytes vernemen, testten we de effecten van isoproterenol, gebruikt bij ^10-7 M (figuur 5C): β-adrenergische stimulatie het verwachte AP verkorting in control myocytes. Het langdurig APD leidt tot een verhoogd risico op vroeg na depolarisaties (EAD) ^23, het optreden van EAD, gedetecteerd als spontane depolarisaties gedurende de plateaufase van de AP, werd gemeten. In HCM hartspiercellen, EBD waren significant vaker voor in vergelijking met controles (figuur 5D). Vertegenwoordiger trace met meerdere EBD is weergegeven in figuur 5E

Om te testen of langer huidige afwijkingen APD en ion excitatie-contractie koppeling mechanismen kunnen beïnvloeden in HCM hartspiercellen, werden de eigenschappen van intracellulaire Ca ^{2 +} varianten getoetst tijdens de stimulatie. De amplitude van Ca ^{2 +} transiënten opgeroepen in de huidige-clamp omstandigheden waren vergelijkbaar in HCM vergelijking met hartspiercellen (figuur 6A) te controleren. Omgekeerd is de kinetiek van Ca ^{2 +} voorbijgaande, significant langer in HCM (figuur6B). Bovendien intracellulaire diastolische Ca ^{2 +-concentratie} was beduidend hoger HCM opzichte cardiomyocyten (figuur 6C) en-toename prominenter bij verhoging van stimulatiefrequentie.

Met name cardiomyocyten geïsoleerd met deze werkwijze uit menselijk ventriculair monsters zijn ook met succes toegepast voor andere toepassingen, zoals voltage-clamp specifieke transmembraan stromen (figuur 7A), intracellulaire ^{Ca2 +} en / of mobiele bakvet opnamen tijdens elektrische veld stimulatie (Figuur 7B) en beoordeling van de fijne structuur van de sarcolemma via confocale microscopie en membraangebonden fluorescerende labels (figuur 7C).

Figuur 1. Stroomdiagram van celisolatie procedure.

Figuur 2. Behandeling van ventriculaire monsters voor celisolatie. (A) Representatieve afbeelding toont een voorbeeld van ventriculaire myocardium van een patiënt met HCM die septum myectomy operatie ondergingen. Kalibratie bar = 5mm. (B) Stukjes ventriculaire weefsel gesneden uit een ventriculaire chirurgische specimen, te gebruiken voor celisolatie. Kalibratie bar = 5mm. (C) Afbeeldingen van de vertering apparaat. De inrichting omvat een digestie kamer met twee silicium borstels: superieure borstel kan draaien wanneer bewogen door een motor (D) Afbeelding van de vertering inrichting het bad met thermostaatregeling tijdens enzymatische digestie van ventriculair weefsel.. p>

Figuur 3. Geïsoleerde menselijke ventriculaire cardiomyocyten. (AB) Het paneel toont microfoto van twee microscoopvelden (10x objectief) tonen representatieve cardiomyocyte schorsingen. Van de nota, ongeveer 30% van de cellen zijn staafvormige en vertonen duidelijke strepen. Kalibratie bar = 100 micrometer. (CE) Vertegenwoordiger beelden van 3 menselijke hartspiercellen geïsoleerd uit een monster uit een HCM patiënt (40x objectief). Kalibratie bar = 20 pm. (F) Afbeelding van een mens ventriculaire cardiomyocyten geraakt door de punt van de patch pipet voor opnames. Kalibratie bar = 20 pm.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
Figuur 4. Gelijktijdig opnemen van membraanpotentiaal en intracellulair calcium. Representatieve traceren met membraanpotentiaal (boven) en intracellulair calcium (hieronder) opgenomen van een myocyten geïsoleerd uit een monster HCM. De myocyten wordt gestimuleerd via de patch pipet 0.2 Hz, 0,5 Hz en 1 Hz.

Figuur 5. Wijzigingen van actiepotentialen in ventriculaire cardiomyocyten uit HCM monsters. (A) Vertegenwoordiger bovenop actiepotentialen opgewekt bij 0,2 Hz, 0,5 Hz en 1 Hz uit een controle myocyte (links, grijs sporen) en een HCM myocyte (rechts, zwarte sporen ). (B) Gemiddelde duur van de actiepotentiaal bij 90% repolarisatie (APD90%) in HCM (n = 81) encontrol cardiomyocyten (n = 29) en drie stimulatie frequenties getest. (C) Voorkomen van EAD in cardiomyocyten van HCM patiënten en controlemonsters. (D) Bovenop actiepotentialen op 0.5Hz van een controle myocyten in de afwezigheid (continue sporen) en in aanwezigheid van 10 ^-7 M isoproterenol. (E) Representatieve traceren met membraanpotentiaal van een hartspiercel van een HCM patiënt die verscheidene spontane depolarisaties die tijdens de plateaufase (vroeg na depolarisaties, EAD), aangegeven door pijlen. Stimuli worden gekenmerkt door korte lijnen onder het spoor. ** = P <0,01 ongepaarde t-test. Alle panelen in de figuur worden gewijzigd met toestemming van Coppini et al.. 2012 ^21.

Figuur6. Veranderingen van calcium transiënten in ventriculaire cardiomyocyten van HCM monsters. (A) Representatieve gesuperponeerd calcium transiënten opgewekt tijdens stimulatie 0.2 Hz via de patch pipet in een besturingselement myocyten (grijs) en een HCM cellen (zwart). Met name heeft de amplitude van Ca ^{2 +} transiënten verschilde niet tussen de twee cellen (B) kinetiek van Ca ^{2 +} transiënten in HCM (n = 42) en controle (n = 24) hartspiercellen:. Tijd van stimulans tot piek van voorbijgaande aard (TP ), tijd van piek tot 50% verval (T50%) en de tijd van piek tot 90% verval van voorbijgaande aard (T90%) worden getoond. (C) Vertegenwoordiger lange sporen toont intracellulaire Ca ^{2 +} tijdens de stimulatie op 3 verschillende frequenties in HCM en controle myocytes, aandacht voor de verhoogde diastolische Ca ^{2 +} bij hoge stimulatiefrequenties in de HCM myocyte. (D) Gemiddelde diastolische Ca ^{2 +} in HCM (n = 42) en controle (n = 24) hartspiercellen op 3 verschillende pacing rates. ** = P <0,01 ongepaarde t-test. Alle panelen in de figuur worden gewijzigd met toestemming van Coppini et al.. 2012 ^21.

.. Figuur 7 Aanvullende experimentele toepassingen met behulp van menselijke hartspiercellen (A) Links: vertegenwoordiger bovenop sporen tonen L-type Ca ^{2 +} stroom opgenomen onder spanning klem op verschillende membraan voltages met een specifiek protocol (zie ²¹ voor details). Rechts: de gemiddelde L-type Ca ^{2 +} stroompiek dichtheid van 18 cellen geïsoleerd van HCM monsters op verschillende membraan. Voltages. (B) intracellulaire Ca ^{2 +} trace opgenomen van een ventriculaire myocyte tijdens elektrische veld stimulatie op 1 Hz. (C) confocale beeld van een ventriculaire cardiomyocyte uit een HCM monster gekleurd met een fluorescerende membraan gebonden kleurstof (Di-3-ANEPPDHQ). Van de nota, de dichtheid van ttubules is laag, wat suggereert morfologische membraan remodeling in HCM.

Figuur 8. De (AB) Onderdelen van de vertering apparaat spijsvertering apparaat.. Een variabele snelheid draaiende motor is verbonden met een eerste plastische arm, die is verbonden met een tweede. De tweede kunststof arm verwijderbaar en verbonden met het bovenste borstel. Borstels zijn gemaakt met siliconen elastomeer. Een PTFE negatieve mal met 100 gaten afstand ~ 1,5 mm werd gebruikt om de borstels gegoten uit vloeibare siliconen. De binnenruimte van de matrijs 1,9 cm diameter is 6 mm, produceert borstels van dezelfde grootte. De gaten gelegen aan een zijde van de mal worden aangebracht om 8 mm lange borstelharen wanneer de borstelszijn gegoten en uit de mal verwijderd. Nadat de vloeibare siliconen in de mal wordt gebracht, worden minstens 48 uur nodig voor uitharding. Borstels worden in een glazen buisje (binnendiameter = 2 cm, dikte 2 mm) en de cilindrische kamer gevormd door de twee borstels en de glazen wanden wordt hermetisch afgedicht door twee rubberen O-ringen. Borstels moeten worden geduwd ene naar de andere; de onderste gelijmd op een plastic basis, terwijl de bovenste gelijmd aan het plastic van de motor arm en dus kan draaien. (C) vergrote weergave van het bovenste borstel. Opmerkelijk, de borstel moet worden gelijmd aan het uiteinde van de motor arm zodat het (D) De componenten van de kamer zijn in hun definitieve positie te draaien. De ruimte tussen de twee borstels (het werkelijke kamer) is ~ 2 cm breed en 7-8 mm; deze ruimte past gemakkelijk 3-4 ml buffer, anders dan tot 1 g myocardium.

Discussion

Wij hebben beschreven en gevalideerde werkwijze levensvatbare myocyten isoleren van chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Vanaf eerder beschreven protocollen die met succes had gebruikt om geïsoleerde cellen van atriale chirurgische monsters, de techniek om de scheiding van enkele levensvatbare myocytes van zieke ventriculaire myocard werd ontwikkeld en verfijnd. Vroege rapporten bleek dat isolatie van enkele hartspiercellen uit brokken van atriale en ventriculaire weefsel selectief verminderde repolarizing kalium stromingen, resulterend in gewijzigde elektrofysiologische eigenschappen en reacties op fysiologische stimuli ^8,24, terwijl de levering van het enzym bevattende buffer via de coronaire perfusie niet aantasten vertraagde gelijkrichter stromingen in isolaat cellen ^25. Helaas kan isolatie van humane hartspiercellen uit chirurgische specimens van ventriculaire myocardium niet worden uitgevoerd door coronaire perfusie sinds de integriteit van coronaire takkenverloren gaat, in strijd met explanted harten. Hartspiercellen geïsoleerd van myocard brokken met behulp van onze methode vertonen een duidelijke aanpassing van de duur van de actiepotentiaal in reactie op veranderingen van pacing frequentie of om adrenerge stimulatie β. Om dergelijke reacties optreden, wordt de integriteit van de vertraagde gelijkrichter kalium kanalen nodig ^26-28, wat suggereert dat de algehele integriteit van deze kanalen wordt niet nadelig beïnvloed door onze isolatie-methode. Daarnaast, cellen geïsoleerd met onze werkwijze tonen niet alleen normale elektrofysiologische respons (figuren 3 en 4), maar ook worden weergegeven calcium transiënten van de verwachte vorm en duur (figuren 3 en 5) en regelmatige sarcomere ordening (Figuur 2) en verkorten eigenschappen (niet getoond), wat suggereert dat de algehele structurele integriteit van de cellen behouden blijft deze isolatieprocedure. De belangrijkste vooruitgang van deze methode ten opzichte van eerderetechnieken door de nieuw ontworpen digestie inrichting, die mechanisch roeren zacht weefsel brokken levert, waardoor enkele cel scheiden zonder sterke beschadiging. Bovendien is het gebruik van het apparaat digestie konden we een lagere concentratie van enzymen te gebruiken in de celisolatie buffer; in het bijzonder zijn we met behulp van een veel lagere concentratie van niet-selectief protease in vergelijking met de eerder gerapporteerde methoden ^24. Het apparaat wordt op maat gemaakt in ons laboratorium: bouwtekeningen zijn weergegeven in figuur 8.

Het eenvoudige ontwerp en de structuur maakt het zeer eenvoudig om te repliceren voor een succesvolle uitkomst van dit protocol. De legenda van Figuur 8 beschrijft ook de voor het produceren van de siliconen borstels en de opbouw schrapen kamer procedures. Vanwege de voordelen van de vertering inrichting kan een relatief hoog aantal levensvatbare cellen worden verkregen uit relatief weinig ventriculaire weefsel (zo laag als 100 mg).Een eerder gepubliceerde werkwijze ¹⁹ werd aangetoond dat een calcium tolerante myocyten bieden van kleine biopsieën (zelfs <20 mg). Echter, de gerapporteerde myocyte opbrengst was zeer laag en de auteurs niet aantonen dat cellen geïsoleerd met die methode haalbaar waren voor de karakterisering van intracellulair calcium fietsen en contractiele functie. Deze techniek is potentieel voor vele chirurgische patiënten, aangezien kleine porties van het septum vaak uitgesneden tijdens klepvervanging procedures (bijv.. Aortaklep vervanging). Echter, het cruciale punt om een ​​succesvolle isolatie te verkrijgen is een snelle inleiding van de procedure na de monsterneming uit de operatiekamer. Daarom is het nodig dat de cel laboratorium in de nabijheid van de hartchirurgie kliniek, zodat deze techniek vruchtbaar. Bovendien, een goede enzymactiviteit is ook uiterst belangrijk voor een succesvolle isolatie. Aangezien de niet-selectieve proteaseactiviteit of iedere collagenase partij is meestal niet volledig getest, elke partij zich waarschijnlijk anders uit te voeren tijdens celisolatie. Het is daarom essentieel selecteerbaar om eindconcentratie van collagenase om de beste resultaten te bereiken. We raden observeren celsuspensie onder de microscoop bij elke cyclus, om te zorgen dat levensvatbare cellen beginnen verschijnend cyclus 3 vroege verschijning cellen suggereert overmatige enzymactiviteit en vraagt ​​naar vermindering van enzymconcentratie.; verschijnen van cellen na cyclus 3 blijkt onvoldoende enzymactiviteit. In onze ervaring is dit de meest effectieve indicator van de juiste enzymconcentratie.

We hebben met succes deze methode gebruikt om enkele hartspiercellen te verkrijgen van de inter-ventriculaire septum van HCM patiënten met linker ventrikel outflow obstructie die een chirurgische septum myectomy, evenals van niet-falende non-hypertrofische chirurgische patiënten ^21. Resultaten van dat papierlaten zien dat myocytes geïsoleerd met deze methode kan worden gebruikt voor complete elektrofysiologische evaluatie met patch clamp technieken en tegelijkertijd de beoordeling EG-koppeling afwijkingen, door het opnemen van intracellulair calcium dynamiek met fluorescerende kleurstoffen. De opnameprocedure beschreven konden weverschillende fysiologische bloedcelparameters met een enkele opname van elke cel verzamelen, waardoor een grote hoeveelheid data met een beperkt aantal cellen en monsters. Dankzij deze voordelen Deze methode is succesvol gebruikt om de specifieke functionele abnormaliteiten van ventriculaire cardiomyocyten van HCM patiënten en, in vergelijking met niet hypertrofische patiënten ^21. Afwijkingen van ionen stromen en actiepotentiaal duur en kinetische afwijkingen od intracellulaire Ca ^{2 +} fietsen werden duidelijk geïdentificeerd met behulp van deze techniek, met een hoge reproduceerbaarheid. Bovendien hebben we aangetoond dat behandeling met een selectieve remmer van late Na ⁺ vs. placebo bij patiënten met HCM ^29, die momenteel aan de gang.

Menselijke beschikbaarheid cardiale specimen relatief bescheiden, zelfs in gespecialiseerde centra, en kan een brede toepasbaarheid van deze techniek beperken. Niettemin, de kwaliteit van de informatie die direct kan worden verkregen van patiënt monsters aan ziekte gerelateerde veranderingen in cardiomyocyt-functie vergelijkbaar met die haalbaar is met dierlijke modellen van HCM en andere hartaandoeningen. Gezien de grote verschillen tussen defysiologie van mensen en muizen hartspiercellen, kunnen gegevens uit functionele evaluatie van de menselijke myocytes uiterst waardevol zijn. Als conclusie, zijn wij van mening dat de toekomstige toepassingen van deze techniek aanzienlijk kunnen bijdragen tot de kennis van hartziekten, aangezien onze protocol voorziet in de mogelijkheid om een ​​complete set van functionele evaluaties uitvoeren rechtstreeks op cellen van patiënt monsters, met onmiddellijke translationele waarde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.