בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Summary

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

Abstract

שריר לב מלב חולה חשופים לתהליכי שיפוץ המורכבים של שינויים במבנה תא, צימוד התכווצות עירור וזרמי יונים בממברנה. שינויים אלה עשויים להיות אחראים לעליית arrhythmogenic שינויי ההתכווצות שמוביל לחוסר תפקוד סיסטולי ודיאסטולי בחולי לב בסיכון ו. עם זאת, רוב המידע על השינויים של תפקוד myocyte במחלות לב הגיע ממודלים של בעלי חיים.

כאן אנו מתארים ולאמת פרוטוקול לבודד myocytes קיימא מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוחי לב. הפרוטוקול מתואר בפירוט. מדידות סידן אלקטרו ותאיות הם דיווחו להוכיח את ההיתכנות של מספר מדידות תא בודדים בשריר הלב של חדר של אדם שנלקח בשיטה זו.

הפרוטוקול דיווח שהואמחדש יכול להיות שימושי לחקירות עתידיות של הבסיס התאי ומולקולרי של שינויים תפקודיים של הלב האנושי בנוכחות מחלות לב שונות. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות מטרות טיפוליות חדשניות ברמה תאית וכדי לבדוק את האפקטיביות של תרכובות חדשות בשריר לב אנושי, עם ערך translational ישיר.

Introduction

Dissection של מאפייני אלקטרו של שריר הלב התקדם במידה ניכרת לאחר הפיתוח של טכניקות לבידוד myocyte לב אחד. פיתוחים אחרונים בהבנה של לב עירור התכווצות צימוד (EC-צימוד) גם כבר מתאפשרים על ידי היכולת של בידוד שריר לב יחיד קיימא ששומרים על כל המאפיינים הפיסיולוגיים של הרקמות שלמות. שיטות מהדק תיקון מועסקות באופן שיגרתי כדי ללמוד את התפקיד ואפנון תרופתי של זרמי יון sarcolemmal לב. הקלטות של דינמיקת סידן תוך תאי עם ^{2 +} צבעים רגישים Ca מבוצעות גם באופן קבוע על myocytes לב אחת ממגוון רחב של דגמים בריאים וחולים, המספקות נתונים חיוניים על הפיסיולוגיה של EC-צימוד כמו גם על השינויים פתולוגיים של תאיים Ca ^{2 +} הומאוסטזיס מוביל לליקוי מכאני וניטל arrhythmogenic מוגבר במחלות לב. Information ממחקרים אלה הוא קריטי להבנת השפעות אלקטרו מכניות של תרופות במסגרת הקלינית. עם זאת, יש הבדלים מסוימים במיני זרמי הטרנסממברני ובחלבוני EC-הצימוד כי חשבון עבור תכונות מסוימות של פוטנציאל פעולת לב ומכניקת לב. וכך, בעוד מחקרים של myocytes מבודד מיונקים שאינם בני אדם שהובהרו מאפייני biophysical ותפקידים פיסיולוגיים של ערוצים ספציפיים הטרנסממברני יון וחלבונים EC-צימוד, הם לא בהכרח לספק מודלים רלוונטיים של myocytes לב האנושי. בידוד של myocytes קיימא משריר הלב אנושי הוא חיוני ולכן כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות לב ולאמת גישות טיפוליות חדשניות.

רקמת פרוזדורי אדם זמינה כנספחי פרוזדורים לעתים קרובות הושלכו במהלך הליכים כירורגיים. מחקרים כמותיים ראשוניים של פוטנציאל למבוגרים פעולה אנושי לבבית ומ"ק היוניrrents מועסק תאי פרוזדורי אנזימים מבודדים ^1-4. הקלטות של פוטנציאל פעולה או זרמים מתאי חדרית בודדים מבוגרים אנושיים דווחו לאחר מכן ^3,5-10. רוב המחקרים הללו השתמשו בתאים המתקבלים מלב explanted ומנוצלים גם זלוף collagenase של קטע לב כלילית או חשיפה של כמויות גדולות היחסי של רקמה שנכרתה לCollagenase להשיג תאים מבודדים. מחקרים אלה אפשרו אפיון מפורט של מספר זרמי יון הטרנסממברני משריר לב חדרית אדם מלב בריא ומחולים עם אי ספיקת לב סופנית. הקלטות של סוג L-Ca ^{2 +} נוכחית (אני _CA-L) ^5-7, נוכחית חולף אשלגן החוצה (אני _ל) ^8, פנימה הנוכחי אשלגן מיישר (אני _κ1) ^8, המרכיבים השונים של זרם אשלגן rectifier מתעכב (אני _κ ) ⁹ כבר דיווחו. התקדמות וזיקוק שלהליך הבידוד ^10, אפשר אפיון ברור של הבסיס היוני של פוטנציאל arrhythmogenic גדל באי ספיקת לב סופנית, הכולל הארכת פוטנציאל פעולת ^11, עיכב אחרי depolarizations ¹² ועלה ¹³ הנוכחיים מצחיקים שהוביל לשלילת קוטביות דיאסטולי ופעימות מוקדמות.

myocytes לב למבוגרים בדרך כלל מבודד מבעלי חיים קטנים על ידי זלוף המדרדר של הלב השלם עם תערובות אנזים שונות, טכניקה שמייצרת תשואות גבוהות של ² תאים ⁺ סובלניים Ca ^14. בידוד של myocytes לב מרסיסים של רקמה הוא מטבעם פחות מוצלח כנראה בגלל הגישה המוגבלת של אנזימים לmyocytes הבודד בהשוואה לזה שהושג ע"י טפטוף של עורקים הכליליים. בגלל הזמינות מוגבלת מאוד של לב תורם שאינו בשימוש, הדרך המעשית היחידה להשיג תאי חדרית אדם נורמלים על בסיס קבוע היא על ידי digestio האנזימטיתn של שברי הרקמה קטנים מאוד לעתים קרובות נכרת במהלך ניתוחים אלקטיביים. מודל המחלה האנושי היחיד שהתאפיין ביסודיות ברמת תא הוא אי ספיקת לב הטרמינל, בשל הנגישות ללב מושתל. עם זאת, אי ספיקת לב מסוף מתרחשת במיעוט של חולים, ולעתים קרובות כרוך במסלול משותף של שיפוץ חמור של תאי שריר הלב, שהיא עצמאית יחסית של הגורם הבסיסי ^15. היכולת להעריך את תפקוד שריר לב אחת מחולים בשלב שאינו כושל קודם של מחלה היא קריטית כדי להבין את הפתופיזיולוגיה מסוימת של תנאים בירושה או רכשו שונים. קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) היא דוגמא מאלפת. HCM הוא נפוץ (1/500 יחידים) מצב לב בירושה מאופיין היפרטרופיה לבבית, גדל שינויי סיכון והתכווצות arrhythmogenic בשל חסימה בדרכי יצוא ותפקוד הדיאסטולי ^16. שריר לב מלב HCM undergo תהליכי שיפוץ מורכבים של שינויים במבנה תא (היפרטרופיה, אנדרלמוסית myofibrillar) ו-EC-צימוד ^17. עם זאת, רוב המידע של חוסר תפקוד myocyte בHCM הגיע ממודלים של בעלי חיים מהונדסים. שכן רק מיעוט של חולי HCM מתפתח לכיוון אי ספיקת לב סופנית ודורש השתלת לב, לב HCM זמין לעתים רחוקות מאוד לבידוד תא עם שיטות סטנדרטיות. עם זאת, לפחות 30% מחולי HCM לפתח סימפטומים חסימתית עקב זרימת דם בדרכי יצוא שינוי היפרטרופיה במחיצה מסיבית במהלך התכווצות (HCM) ^18. האופציה הטיפולית זמינה היעילה ביותר להקלה על החסימה בHCM היא myectomy מחיצה כירורגית: בהליך כירורגים זה, חלק בגודל משתנה של עליונה מחיצה הוסר על ידי גישה של אב העורקים טראנס. חלק זה של מחיצת אף יתר על לכן הוא זמין לבידוד תא מהרקמה הטרי.

שיטה לבידוד של ventricula אדםr myocytes מדגימות בודדות, קטנות transvenous endomyocardial ביופסיה כבר פותח בעבר ופורסם ^19. אנחנו יישמנו שיטה לבודד myocytes במחיצה אחת מדגימות שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוח לב, לרבות חולים עם HCM עוברים myectomy וחולים שעברו הליכים להחלפת שסתום במחיצה. בנוסף לתיאור מפורט של פרוטוקול הבידוד, אלקטרו הנציג וCa ^{2 +} הקרינה מדידות מוצגות, הוכחת הכדאיות של myocytes חדרית האדם המבודד ואת הכדאיות של מהדק התיקון וCa ^{2 +} מחקרים תאיים.

Protocol

פרוטוקולי הניסוי ברקמות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Careggi-החולים (2006 / 0,024,713; מאי מחודש 2009). כל מטופל נתן הסכמה מדעת בכתב.

1. פתרונות וציוד הכנה

פתרונות מתוארים בטבלה 1. תרשים זרימה פשוטה של הליך בידוד התא נמצאת באיור 1.

פתרון		CP	DB	KB	שחפת	נ.ב.	EB1	EB2
מגיב (מ"מ)	KH 2 PO 4	50
	4 MgSO	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	אדנוזין	5
	גלוקוז	140	10	20	10		10	10
	מניטול	100
	טאורין	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl 2		</ Td>		1.2	5
	KH 2 PO 4		0.6	30			0.6	0.6
	Na 2 HPO 4		0.6				0.6	0.6
	NaHCO 3		12				12	12
	KHCO 3		10				10	10
	Na-פירובט		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5 </ Td>
	חומצת succinic			5
	EGTA			0.5
	K-2-ATP			2
	חומצת pyruvic			5
	קריאטין			5
	KMES					115
אנזימים (U / ml)	Collagenase סוג V						250 </ Td>	250
	פרוטאז סוג XXIV						4
pH		7.4 KOH	7.3 NaOH	7.1 KOH	7.35 NaOH	7.2 KOH	7.3 NaOH	7.3 NaOH

. טבלה 1 פתרונות המשמשים לאיסוף דגימה, בידוד תא ואפיון פונקציונלי של myocytes = פתרון cardioplegic CP.; DB = חיץ ניתוק; KB = פתרון קראפט-Bruhe; TB = חיץ Tyrode; נ.ב. = פתרון פיפטה; EB1 = חיץ אנזים 1; EB2 = אנזים חיץ 2.

1. הכן cardioplegic פתרון (CP). פתרון CP יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע עד 1.
2. הכן את Ca ² חיץ ניתוק ללא ⁺ (DB). יש להשתמש בפתרון זה בתוך היום.
3. הכן פתרון קראפט-Bruhe (KB). פתרון KB יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך הקטנות של הלילה עד 1k.
4. הכן את Ca ² חיץ ללא ⁺ Tyrode (TB). יש להשתמש בפתרון זה בתוך היום.
5. לסנן את כל הפתרונות באמצעות מסנני מזרק לפני השימוש.
6. הכן את מכשיר העיכול (איור 2), מיכל גירוד עשוי שתי מברשות מול של אלסטומר סיליקון, שאחד מהם מסובבים על ידי מנוע חשמלי. מכשיר העיכול מורכב מותאם אישית. פרטים על מכשיר העיכול הם באיור 8; תמונות של המכשיר הן באיורים 2 C ו 2D. שטוף את חדר הרקמות עם 70% אתנול ומים.

2. איסוף ועיבוד של דוגמאות שריר הלב

1. יוצקים 40 מיליליטר של cardiplegic פתרון (CP) בצינור 50 מ"ל ולאחסן אותו בקרח לתחבורה דגימה מחדר הניתוח למעבדה בידוד תא.
2. לאסוף את דגימת שריר הלב חדרית מחדר הניתוח באופן מיידי לאחר כריתה, לשטוף אותו עם קרח קרפתרון CP ולאחסן אותו בצינור. השתמש בדגימות endocardial נכרתה מן מחצה העליונה בין חדרית במהלך ניתוח לב פתוח, שקלול> 100 מ"ג.
3. במהירות להעביר את הדגימה לאזור המעבדה; להתחיל עיבוד דגימה בתוך 10 דקות מכריתת דגימה.
4. תוך שמירה על הדגימה במאגר CP הקר כקרח, להסיר בזהירות את שכבת fibrotic endocardial באמצעות מספריים עדינים תחת סטראו; לאחר מכן, חותך את רקמת שריר הלב לחתיכות קטנות (2-3 מ"מ אורך). בהתאם לגודל דגימת רקמה, לקצץ בסכום כולל של שריר הלב חדרית בין 100 מ"ג ו 1 גרם לכל בידוד.
5. עם השלמת מתייפייפת רקמה, להעביר את נתחי שריר הלב לתוך מכשיר העיכול, עם פתרון CP קרח הקר ונקי. הימנע ממילוי כל הנפח שבין שתי מברשות סיליקון (3-4 מיליליטר) עם נתחי שריר הלב, באמצעות לא יותר מ 1 גרם של רקמה בסך הכל.

3. כביסה ועיכול של שריר הלב גושים

1. בירכתי הספינהאה נתחים מועברים לתוך תא הגירוד של מכשיר העיכול, לשנות את חיץ CP בתא עם ² חיץ Ca הקר ⁺ ללא ניתוק (DB).
2. מניחים את מכשיר העיכול באמבט תרמוסטטי, על מנת שהחדר יהיה במגע עם המים מחוממים באמבטיה (איור 1). הגדר את האמבטיה ל37.5 ° C ולהפעיל אותו, על מנת להעלות את הטמפרטורה של חדר הרקמות לאט. הפעל את המנוע של מכשיר העיכול, קביעת מהירות הסיבוב עד 1 מהפכה / שני.
3. בצע 3 מחזורי כביסה עם DB, שינוי הפתרון בתא עם DB הנקי בכל 8 דקות. DB הוא התחמם (37 מעלות צלזיוס) וחמצן רווי לפני מקבל במגע עם נתחי שריר הלב.
4. הכן את חיץ אנזים 1 (EB1) על ידי הוספת 250 U / מיליליטר של Collagenase סוג V ו4 U / ml פרוטאז סוג XXIV לפתרון DB. הכן את אנזים חיץ 2 (EB2) על ידי הוספת 250 U / ml Collagenase סוג V לפתרון DB. להתחמם (37 מעלות צלזיוס) וoxygenatEB1 הדואר וEB2.
5. בצע שני מחזורי 12 דקות של עיכול במכשיר העיכול מסתובב עם 100% EB1 מחומצן (על 37 מעלות צלזיוס). בכל מחזור, השתמש ~ 3 מיליליטר של EB1. הסר את הפתרון על ידי שאיפה פיפטה וזורקים אותו אחרי כל מחזור.
6. הכן 6 15 מיליליטר צינורות לאיסוף תא ו~ 80 מיליליטר של תמיסת KB (4 ° C) קרה למשחררי המאגרים.
7. בצע מחזור עיכול 15 דקות ראשונה עם 100% EB2 חומץ 3 מיליליטר ב 37 ° C. לאחר מחזור העיכול, לאסוף את התמיסה המכילה myocytes ניתק הראשון בצינור 15 מ"ל ולדלל את ההשעיה התא עם פתרון KB הקר 12 מיליליטר. אחסן את שטוח צינור בטמפרטורת חדר.
8. לדלל את פתרון EB2 שנותר עם כמות שווה של DB על מנת לקצץ בחצי את הריכוז של V collagenase למחזורים הבאים העיכול.
9. בצע מחזורי 5 עיכול דקות 12 אחרים עם 3 EB2 מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס; לאחר כל אחד מהם לאסוף של myocyte המכיל חיץ בצינור חרוטי 15 מיליליטר ולדלל אותו עם 12 פתרון KB מיליליטר. אחסן את 6 צינורות תא המכיל בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.

4. Resuspension הנייד וCa ^{2 +} Readaptation

1. הוספת מ"ג / אלבומין 1 מיליליטר שור בסרום (BSA) ל20 מיליליטר חיץ ² Tyrode ⁺ ללא Ca (TB). סנן את הפתרון.
2. צנטריפוגה שישה צינורות חרוטי myocyte המכיל בדקות 5 100 XG לכפות myocytes להתיישב. הסר את supernatant ו resuspend התאים בצינור אחד עם כמות משתנה (1-3 מיליליטר, תלוי בתשואה) של BSA המכילה TB ב RT.
3. בהדרגה להגדיל את Ca ^{2 +} ריכוז בחיץ התא המכיל על ידי הוספת aliquots הקטנים של 100 CaCl מילימול / ליטר ₂ פתרון. בשלבים הראשונים והשני Ca ^{2 +} ריכוז עולה עד 50 μmol / L ו100 μmol / L, בהתאמה. שלבי ^{2 +} התוספת הבאה Ca מבוצעים כל 5 דקות והריכוז הוא העלה 100 μmol / L בכל t צעדהריכוז הסופי של OA 0.9 מילימול / ל '
4. להעריך את התשואה של הליך הבידוד. העבר 0.5 מיליליטר של תמיסה המכיל myocyte על חדר תחתית הזכוכית של מיקרוסקופ. להעריך 15 שדות מיקרוסקופ בהגדלה 10x אובייקטיבי ולחשב את אחוז myocytes בריא (תאים למשל מוט מעוצב עם פסים ברורים ואין תכלילים משמעותיים, איור 2). התשואה הצפויה היא בסביבות 20%.

5. הערכה תפקודית של שריר לב מבודד.

הפרוטוקול הבא הוא דוגמא להערכה תפקודית cardiomyocyte אדם כוללים הקלטות בו זמנית של פוטנציאל פעולה ^{ו2 +} נתיבי תאיים Ca.

1. הכן פתרון פיפטה (PS) עבור ניסויי מהדק תיקון בתצורת תיקון מחורר. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
2. הוסף 1.8 מילימול / ליטר CaCl ₂ Ca ^{2 +} ללא חיץ Tyrode (TB). Use פתרון זה עבור superfusion של שריר לב במהלך ניסויי מהדק תיקון / הקרינה.
3. העברת 1 מיליליטר של השעיה תא צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 10 μmol / L Fluoforte ו10 תרכיז Powerload μl. דגירה במשך 30 דקות ב RT. לאחר מכן, קבע את הצינור במצב אנכי ולעזוב את התא להתפשר על 5 דקות; resuspend התאים המכילים Ca ² TB ^+.
4. העבר 0.25 מיליליטר של השעיה תא קטן (0.5 מיליליטר), מיקרוסקופ הטמפרטורה מבוקרת רכוב חדר הקלטה, superfused על ידי כוח הכבידה עם מערכת microperfusor מחוממת בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / דקה (טמפרטורה: 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס).
5. באמצעות חולץ micropipette, להכין טפטפות מהדק תיקון בקוטר טיפ של 3 עד 5 מיקרומטר והתנגדות של 3-4.5 M כאשר התמלאו PS.
6. הוספת amphotericin B לקבוצה של PS (250 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהשתמש בו כדי למלא את האלקטרודות.
7. בחר תא בצורת מוט עם פסים ברורים, נטול תכלילים, עבורrm החותם וגיגה לחכות 5 דקות עד 10, עד שהתנגדות גישה יורדת מתחת 20 MΩ.
8. לעורר פוטנציאל פעולה במצב הנוכחי מהדק באמצעות פולסים קצרים (<3 אלפיות שני) בתדרים שונים של גירוי (Hz 0.2, 0.5 הרץ ורץ 1, 1 דקות בכל תדר). במהלך שלב ההקלטה, להדליק תאורה בשדה בהירה ב492 ± 3 ננומטר ולזהות הקרינה Fluoforte ב505-520 ננומטר. לרכוש הקרינה וקרום אותות פוטנציאליים באמצעות Digidata 1440A וpClamp 10.0 תוכנה. חזור על רצף ההקלטה מספר פעמים במידת הצורך; עם זאת, לשמור על זמן ההקלטה הכולל מתחת 15 דקות לכל תא.

Representative Results

השיטה שתוארה לעיל הועסקה לאפיין את הליקויים תפקודיים של שריר לב מבודד ממחיצת interventricular של חולים עם קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) שעברו ניתוח myectomy, בהשוואה לחולים שאינם כושלים שאינו hypertrophic כירורגית ^21. התוצאות הכלולות בסעיף זה נובעות מהעבודה ^ש21 ומוצגות כאן כדוגמא לאופן שטכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לאפיין את השינויים בתפקוד תא בשריר הלב בתנאי מחלת לב.

מדגם כירורגית נציג ממטופל עם HCM מוצג באיור 2 א. דגימות ניתוחיות היו משתנים באופן קיצוני במונחים של גודל ועובי של הפסים סיביים endocardial. כמות רקמת שריר הלב שאנחנו משמשים עבור כל הליך בידוד מדגימות HCM הייתה סביב 1G. במקום זאת, כמות הרקמה משמשת לדגימות בקרה הייתה קטנה יותר (100-500 מ"ג.), בשל Lower זמינה רקמות. התשואה הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי כאשר דגימות בקרה עובדו ביחס לHCM, כנראה בגלל הכמות היחסית של תאי שריר הלב קיימא בתוך הרקמה מופחתת בשריר לב HCM וסיסטיק endomyocardial הוא גדל ^22. מתצפית אלה הגענו למסקנה כי את הכמות הנדרשת של רקמות להשיג תאי קיימא עשויה להיות משתנה בהתאם להיעדרות או הנוכחות של מחלת שריר הלב.

דוגמאות היו חתוכות לחתיכות קטנות כפי שמוצגות באיור 2. לאחר מכן, נתחים הועברו לתוך התא של מכשיר העיכול (איור 2 ג) ומשמשים לבידוד תא בודד כפי שתואר לעיל (איור 2 ד). photomicrographs נציג של השעיה תא שהושגה באמצעות הליך בידוד התא תאר ממדגם מחץ interventricular מוצג ב3A דמויות ו3B; תמונות מוגדלות של ca חדרית הבודדrdiomyocytes מתואר באיורים 3C-3F. Cardiomyocytes מדגימות HCM שימש להקלטות בו זמנית של פוטנציאל פעולה וCa ² וריאציות ⁺ תאיים כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. עקבות בו זמנית נציג מראים מתח קרום (לעיל) ותאיים Ca ^{2 +} (בהמשך) במהלך גירוי ב3 תדרים שונים מוצגות באיור 4: עקבות אלה נרשמו מcardiomyocyte אחת מבודד ממדגם HCM.

תוצאות של מחקרי מהדק התיקון הראו כי משך הפעולה הפוטנציאלי (APD) שנרשם בתדרים שונים של גירוי היה ממושך במידה ניכרת בשריר לב של חולים עם HCM (שריר לב HCM) בהשוואה לקבוצת ביקורת (איור 5 א ו5 ב). כדי לברר את התחזוקה של תגובות פיסיולוגיות בmyocytes המבודד, שבדקנו את ההשפעות של isoproterenol, המשמש ^ב10-7 M (איור 5 ג): β-adrenerגירוי GIC הפיק את קיצור AP הצפוי בmyocytes שליטה. מאז APD הממושך מוביל לסיכון מוגבר למוקדם לאחר depolarisations (EADs) ^23, את המופע של EADS, זוהה depolarisations ספונטני כמו בשלב הרמה של סוכנות הידיעות AP, נמדד. בשריר לב HCM, EADS היו באופן משמעותי תכופים יותר בהשוואה לקבוצת ביקורת (איור 5D). עקבות נציג מראים EADs מרובה מוצגת באיור 5E

כדי לבדוק אם ליקויים הנוכחיים APD ויון עוד עשויים להשפיע על מנגנוני צימוד עירור והתכווצות בשריר לב HCM, את המאפיינים של ^{2 +} וריאציות תאיים Ca הוערכו במהלך גירוי. המשרעת של Ca ^{2 +} ארעיים עוררה בתנאים הנוכחי מהדק היתה דומה בHCM לעומת השליטה שריר לב (איור 6 א). לעומת זאת, קינטיקה של Ca ^{2 +} ארעי, היו באופן משמעותי יותר בHCM (איור6 ב). בנוסף, Ca ^{2 +} ריכוז דיאסטולי תאיים היה משמעותי גבוה יותר בHCM לעומת השליטה שריר לב (איור 6C) וגדל בצורה בולטת יותר על עלייה בתדירות גירוי.

יש לציין, שריר לב מבודד בשיטה זו מדגימות חדרית אדם יש גם מועסק בהצלחה ליישומים אחרים, כוללים הקלטות המתח-clamp של זרמים הטרנסממברני הספציפיים (איור 7 א), תאיים Ca ^{2 +} ו / או תא (איור קיצור הקלטות במהלך גירוי שדה חשמלי 7 ב) והערכה של המבנה העדין של sarcolemma באמצעות מיקרוסקופיה confocal ותוויות קרום הנכנס ניאון (איור 7C).

איור 1. תרשים זרימה של הליך בידוד תא.

איור 2. עיבוד של דגימות חדרית לבידוד תא. (א) תמונת נציג מראה מדגם של שריר הלב חדרית ממטופל עם HCM, שעבר ניתוח במחיצה בין myectomy. גושי בר = 5 מ"מ כיול. (ב) לחתוך רקמות חדרית מדגימה כירורגית חדרית, שישמש לבידוד תא. בר כיול = תמונות 5 מ"מ. (C) של מכשיר העיכול. המכשיר מורכב מתא עיכול עם שתי מברשות סיליקון: המברשת מעולה יכולה לסובב כאשר עברו על ידי מנוע תמונה (ד ') מראה את מכשיר העיכול באמבטיה thermostated במהלך עיכול אנזימטי של רקמת חדרית.. p>

איור 3. Cardiomyocytes חדרית אדם מבודד. (AB) הלוח מציג photomicrographs של שני שדות מיקרוסקופ (10x אובייקטיבי) מראה השעיות cardiomyocyte נציג. ראוי לציין, כ 30% מתאים הם מוט בצורה ולהראות פסים ברורים. בר כיול = 100 מיקרומטר. (CE) נציג תמונות של 3 cardiomyocytes אדם מבודד מדגימה של מטופל HCM (40X אובייקטיבי). בר כיול = תמונת 20μm. (F) מראה cardiomyocytes חדרית אדם נגע בקצה פיפטה את התיקון להקלטות. בר כיול = 20μm.

"Src =" es.jpg / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
איור 4. הקלטה בו זמנית של פוטנציאל קרום וסידן תוך תאי. עקבות נציג מראים סידן פוטנציאל (לעיל) ותאי קרום (להלן) שנרשמו מmyocyte אחת מבודד ממדגם HCM. Myocyte מגורה באמצעות פיפטה את התיקון ב0.2 הרץ, הרץ והרץ 0.5 1.

נציג איור 5. שינויים של פוטנציאל פעולה בשריר לב חדרית מדגימות HCM. () גבי פוטנציאל פעולה שהושרו ב0.2 הרץ, הרץ ורץ 0.5 1 מ myocyte שליטה (משמאל, עקבות אפורות) וmyocyte HCM (מימין, עקבות שחורות ). משך (ב) פעולה הממוצעת פוטנציאל בrepolarization 90% (APD90%) בHCM (n = 81) ומופע cardiomyocytes ביקורת (n = 29) בשלושת תדרי צעדה נבדקו. (C) של EADS בשריר לב של חולי HCM ודגימות בקרה. (ד ') על גבי זו פוטנציאל פעולה ב0.5Hz מmyocyte שליטה בהעדר (עקבות רציפות) ו בנוכחות 10 ^-7 isoproterenol M. (E) עקבות נציג מראים פוטנציאל הממברנה של cardiomyocyte ממטופל HCM מוצגות כמה depolarizations הספונטני מתרחש במהלך שלב המפנה (מוקדם לאחר depolarizations, EADS), מסומן על ידי חצים. גירויים מסומנים בקווים קצרים מתחת לעקבות. ** = P <0.01 מבחן t מזווג. כל הפנלים בדמות שונו באישור Coppini et al. 2012 ^21.

דמותנציג 6. שינויים של ארעיים סידן בשריר לב של חדר מדגימות HCM. () גבי ארעיים סידן שהושרו במהלך גירוי ב0.2 הרץ באמצעות פיפטה את התיקון בmyocyte שליטה (האפור) ותא HCM (שחור). יש לציין, את המשרעת של Ca ^{2 +} ארעיים אינה שונה בין שני התאים קינטיקה (B) של Ca ^{2 +} ארעיים בHCM (n = 42) וביקורת (n = 24) שריר לב:. זמן מגירוי לשיא חולף (TP ), זמן מהשיא לריקבון 50% (% T50) ופעם מפסגה לריקבון 90% מחולפים (% T90) מוצג. (C) עקבות ארוכות נציג מראים תאיים Ca ^{2 +} בזמן גירוי ב3 תדרים שונים ובHCM myocytes שליטה, המדגיש את Ca הדיאסטולי המוגבר ^{2 +} בשיעורים גבוהים בצעדת myocyte HCM. (ד ') Ca דיאסטולי הממוצע ^{2 +} בHCM (n = 42) וביקורת (n = 24) שריר לב ב3 ra צעדה שונהtes. ** = P <0.01 מבחן t מזווג. כל הפנלים בדמות שונו באישור Coppini et al. 2012 ^21.

.. איור 7 יישומים נוספים ניסיוניים באמצעות myocytes חדרית האנושי () מימין: נציג גבי עקבות מראים סוג L-Ca ^{2 +} הנוכחי נרשם תחת מהדק מתח במתח קרום שונה עם פרוטוקול ספציפי (ראה ²¹ לפרטים נוספים). מימין: L-סוג ממוצע Ca ^{2 +} צפיפות שיא נוכחית מ18 תאים שבודדו דגימות HCM בקרום שונה. מתחים. (ב ') תאית Ca ^{2 +} קורט נרשם מmyocyte חדרית במהלך גירוי שדה חשמלי ברץ 1. (C) Confocal תמונה של cardiom חדריתyocyte ממדגם HCM המוכתם בצבע פלואורסצנטי קרום מאוגד (Di-3-ANEPPDHQ). ראוי לציין, הצפיפות של ttubules היא נמוכה, מה שמראה שיפוץ קרום מורפולוגיים בHCM.

איור 8. מכשיר העיכול. (AB) הרכיבים של מכשיר העיכול. מנוע מסתובב מהירות משתנה מחובר לזרוע פלסטיק ראשונה, שמחובר לאחד שני. הזרוע השנייה היא הפלסטיק נשלפת ומחובר למברשת העליונה. מברשות עשויות עם אלסטומר סיליקון. עובש שלילי PTFE, עם 100 חורים במרווחים ~ 1.5 מ"מ היה בשימוש כדי להטיל את המברשות מסיליקון הנוזלי. החלל הפנימי של העובש יש 1.9 קוטר סנטימטר והוא 6 מ"מ עובי, ייצור מברשות באותו הגודל. החורים ממוקמים בצד אחד של העובש מיוצרים על מנת לייצר זיפים ארוכים 8 מ"מ כאשר המברשותנוצקו והוסר מן התבנית. לאחר סיליקון הנוזלי הוא להכניס את התבנית, לפחות 48 שעות נדרשות להתקשות מלאה. מברשות הם רכובים בתוך שפופרת זכוכית (קוטר פנימי = 2 סנטימטר; 2 מ"מ העובי) והתא הגלילי הוקם על ידי שתי מברשות וקירות הזכוכית אטומה הרמטית על ידי שתי O-טבעות גומי. מברשות צריכה להיות דחף אחד למשנהו; בתחתית אחד מודבק על בסיס פלסטיק, ואילו העליון מודבקת לסוף הפלסטיק של זרוע מנוע ובכך יכול לסובב. (C) מוגדל נופים של המברשת העליונה. ראוי לציין, המברשת צריכה להיות דבוקה לקצה של זרוע המנוע על מנת שזה כדי לסובב (ד ') הרכיבים של החדר מוצגים במיקום הסופי שלהם. החלל שבין שתי המברשות (הקאמרית בפועל) הוא ~ 2 ס"מ רוחב ו 7-8 מ"מ גבוה; החלל הזה נכנס בקלות 3-4 מיליליטר של חיץ, אחר מאשר עד 1 גרם של רקמת שריר הלב.

Discussion

שתארנו ומאומתים שיטה לבודד myocytes קיימא מדגימות כירורגית של שריר הלב חדרית האנושי. החל מפרוטוקולים שתוארו קודם לכן, ששימש בהצלחה לתאים מבודדים מדגימות ניתוחיות פרוזדורים, הטכניקה כדי לאפשר הפרדת myocytes קיימא אחת משריר הלב של חדר חולה פותחה ומכויל. דיווחים מוקדמים הראו כי בידוד של שריר לב אחת מהחתיכות של רקמת פרוזדורים וחדרים סלקטיבי לקויה repolarizing זרמי אשלגן, וכתוצאה מכך שינו את מאפייני אלקטרו ותגובות לגירויים פיסיולוגיים ^8,24, ואילו משלוח של האנזים המכיל חיץ באמצעות זלוף כלילית לא לפגוע במיישר מושהה זרמים בתאים מבודדים ^25. למרבה הצער, בידוד של myocytes חדרית אדם מדגימות כירורגית של שריר הלב חדרית לא יכול להתבצע על ידי זלוף כלילי מאז היושרה של סניפים כלילייםהולכים לאיבוד, בשונות עם לבבות explanted. שריר לב מבודד מנתחי שריר הלב באמצעות השיטה שלנו להציג הסתגלות ברורה של משך פוטנציאל פעולה בתגובה לשינויים בתדירות לצעוד או לβ גירוי adrenergic. על מנת שתגובות כזה להתרחש, על היושרה של תעלות אשלגן rectifier מתעכבת נדרשת ^26-28, דבר המצביע על השלמות הכוללת של ערוצים אלה לא נפגע על ידי שיטת הבידוד שלנו. בנוסף, תאים מבודדים עם השיטות שלנו להראות לא רק את תגובות אלקטרו רגילות (איורים 3 ו -4), אבל גם להציג ארעיים סידן של צורה ומשך הצפויים (איורים 3 ו -5) וארגון sarcomeric רגיל (איור 2) ומאפייני קיצור (לא מוצג), טוען כי השלמות המבנית הכוללת של תאים אלה נשמרת על ידי הליך הבידוד הזה. הקידום העיקרי של שיטה זו על פני קודםטכניקות מסופקת על ידי מכשיר העיכול החדש תוכנן, אשר מספק ערבוב מכאני עדין של נתחי רקמה, המאפשר הפרדת תא בודדת ללא נזק מוגזם. יתר על כן, השימוש במכשיר העיכול אפשר לנו להעסיק ריכוז נמוך יותר של אנזימים בחיץ בידוד תא; בפרט אנו משתמשים ריכוז נמוך בהרבה של פרוטאז לא בררני בהשוואה לשיטות שדווחו בעבר ^24. המכשיר מורכב מותאם אישית במעבדה שלנו: שרטוטי בניין מוצגים באיור 8.

העיצוב והמבנה הפשוט הופכים אותו קל מאוד לשכפל לתוצאה מוצלחת של פרוטוקול זה. אגדת איור 8 מתארת ​​גם את ההליכים הנדרשים לייצור מברשות סיליקון ובניית תא הגירוד. בשל היתרונות של מכשיר העיכול, ניתן להשיג מספר גבוה יחסית של תאי קיימא מכמות נמוכה יחסית של רקמת חדרית (נמוכה כמו 100 מ"ג).שיטה פורסמה בעבר ¹⁹ הוצגה לספק myocytes סובלני סידן מביופסיות קטנות (אפילו <20 מ"ג). עם זאת, תשואת myocyte דווחה הייתה נמוכה מאוד וחבריו לא הססתי להראות אם התאים מבודדים עם שיטה שהיו אפשריים לאפיון של רכיבה על אופניים סידן תוך תאי ותפקוד התכווצות. טכניקה זו היא שעלולה להיות רלוונטית להרבה חולים כירורגי, שכן מנות קטנות של מחיצת אף interventricular לעתים קרובות נכרתה במהלך הליכי החלפה מסתם (למשל. להחלפת שסתום אב העורקים). עם זאת, הנקודה חיונית כדי להשיג בידוד מוצלח היא ייזום מהיר של ההליך לאחר איסוף דגימה מחדר הניתוח. לפיכך, הוא נדרש למעבדת התא להיות בסמיכות למרפאת ניתוח הלב, על מנת שטכניקה זו כדי להיות פורה. בנוסף, פעילות אנזים תקינה היא גם מאוד חשובה לבידוד מוצלח. מאז o פעילות פרוטאז לא הבררניתf כל אצווה collagenase בדרך כלל לא נבדקה לחלוטין, כל מנה עשוי לבצע באופן שונה במהלך בידוד תא. לכן זה חיוני כדי לכוונן את הריכוז הסופי של collagenase על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר. אנו מציעים התבוננות השעיה תא מתחת למיקרוסקופ בכל מחזור, על מנת להיות בטוח שתאי קיימא יתחילו להופיע במחזור 3 הופעה מוקדמת של תאים מצביעה על פעילות אנזים מוגזמת ומבקשת לכיוון ההפחתה של ריכוז אנזים.; מראה של תאים לאחר מחזור 3 מציע פעילות אנזים מספיקה. מניסיוננו, זה הוא אינדיקטור היעיל ביותר של ריכוז האנזים הנכון.

אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי להשיג שריר לב אחת מהמחיצה בין חדרית של חולי HCM עם חסימה בדרכי של חדר שמאלי יצוא עוברת myectomy מחיצה כירורגית, כמו גם מחולים כירורגי שאינו hypertrophic אינו כושל ^21. תוצאות מנייר שמראה כי myocytes מבודד בשיטה זו יכול להיות מועסק להערכת אלקטרו להשלים עם טכניקות מהדק תיקון תוך הערכה בו זמנית מומים EC-צימוד, על ידי הקלטת דינמיקת סידן תוך תאי עם צבעי ניאון. הליך ההקלטה שתואר כאן אפשר לנו לאסוף כמה פרמטרים פיסיולוגיים בתא הקלטה אחת מכל תא, ובכך לייצר כמות גדולה של נתונים עם מספר מצומצם של תאים ודגימות. הודות ליתרונות אלה, שיטה זו שמשה בהצלחה כדי לאפיין את הליקויים תפקודיים הספציפיים של שריר לב חדרית מחולי HCM, בהשוואה לחולים שאינם hypertrophic ^21. ליקויים של זרמי יון ומשך פוטנציאל פעולה, כמו גם חריגות הקינטית Ca ^{2 +} רכיבה על אופניים תאיים OD זוהו בבירור שימוש בטכניקה זו, עם שחזור גבוה. בנוסף, הראינו כי טיפול במעכב סלקטיבי של סוף Na ⁺ vs. פלצבו בחולים עם ²⁹ HCM, אשר נמצא כעת מתמשכת.

זמינות דגימת לב אנושית הוא יחסית צנוע, גם במרכזים מיוחדים, וזה עלול להגביל את תחולתו רחבה של טכניקה זו. יחד עם זאת, האיכות של מידע שניתן באופן ישיר המתקבל מדגימות חולים במחלה הקשורה לשינויים בתפקוד cardiomyocyte דומה לזו השגה ממודלים של בעלי החיים של HCM ומחלות לב אחרות. לאור ההבדלים הנרחב ביןפיזיולוגיה של myocytes לב האנושי והעכברי, נתוני הערכה תפקודית של myocytes אדם יכול להיות יקרים מאוד. כסיכום, אנו מאמינים שיישומים עתידיים של טכניקה זו יכול לתרום באופן משמעותי לידע של מחלות לב, שכן הפרוטוקול שלנו מספק את האפשרות לבצע סדרה של הערכות תפקודיות מלאה ישירות על תאים מדגימות חולים, עם ערך translational מיידי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.