Isolasjon og Funksjonell karakterisering av menneskelig Ventrikulær Cardiomyocytes fra Fresh Kirurgiske Samples

Summary

Nåværende kunnskap om cellulære grunnlag av hjertesykdommer stort sett er avhengig av studier på dyremodeller. Her beskriver vi og validere en ny metode for å oppnå enkle levedyktige cardiomyocytes fra små kirurgiske prøver av menneskelig ventrikkel myokard. Menneskelige ventrikulære myocytter kan benyttes til elektrofysiologiske studier og medikamenttesting.

Abstract

Cardiomyocytes fra syke hjerter er utsatt for komplekse remodeling prosesser med endringer i cellestrukturen, eksitasjon kontraksjon kopling og membran ion strømninger. Disse endringene vil trolig være ansvarlig for den økte arytmogene risiko og kontraktile endringer som fører til systolisk og diastolisk dysfunksjon hos hjertepasienter. Men har mest mulig informasjon om de endringer av myocyte funksjon i hjertesykdommer kommer fra dyremodeller.

Her beskriver vi og validere en protokoll for å isolere levedyktige myocytes fra små kirurgiske prøver av ventrikkel myokard fra pasienter som gjennomgår hjertekirurgi operasjoner. Protokollen er beskrevet i detalj. Elektrofysiologiske og intracellulære kalsium målinger er rapportert å demonstrere gjennomførbarheten av et antall enkeltcellemålinger i humane ventrikulære cardiomyocytes oppnådd med denne metoden.

Protokollen rapporterte hanre kan være nyttig for fremtidige undersøkelser av cellulære og molekylære basis av funksjonelle forandringer av det menneskelige hjerte i nærvær av forskjellige hjertesykdommer. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes for å identifisere nye terapeutiske mål på cellenivå, og for å teste effektiviteten av nye forbindelser på human cardiomyocytes, med direkte overføringsverdi.

Introduction

Disseksjon av de elektrofysiologiske egenskapene til hjertemuskelen har utviklet seg betydelig etter utvikling av teknikker for enkelt hjerte myocyte isolasjon. Nye fremskritt i forståelsen av hjerte eksitasjon kontraksjon kopling (EC-Coupling) har også blitt gjort mulig ved evnen til å isolere levedyktige enkelt cardiomyocytes som beholder alle de fysiologiske egenskapene til intakt vev. Patch klemme metoder blir rutinemessig brukt for å studere funksjonen og farmakologisk modulering av hjerte sarcolemmal ion strømninger. Opptak av intracellulære kalsium dynamikk med Ca ^{2 +} sensitive fargestoffer er også jevnlig utført på enkelthjertemuskelceller fra en rekke friske og syke modeller, og gir viktige data om fysiologi av EF-Coupling samt på de patologiske endringer av intracellulær Ca ^{2 +} homeostase fører til mekanisk svikt og økt arytmogene byrde i hjertesykdommer. Informasjon fra disse studiene er avgjørende for å forstå de elektrofysiologiske og mekaniske effekter av legemidler i klinisk setting. Det er imidlertid artsspesifikke forskjeller i transmembrane strømninger og i EF-Coupling proteiner som står for bestemte funksjoner i hjertets aksjonspotensial og hjerte mekanikk. Således, mens studier av myocytes isolert fra ikke-menneskelige pattedyr har belyst de biofysiske egenskaper og fysiologiske roller spesifikke transmembrane ionekanaler og EC-Coupling proteiner, de gir ikke nødvendigvis relevante modeller av menneskelig hjertemuskelceller. Isolering av levedyktige myocytes fra menneskelige myokard er derfor viktig å fullt ut forstå patofysiologien av hjertesykdommer og validere nye terapeutiske tilnærminger.

Humant atrielle vev er lett tilgjengelig som atriale vedheng blir ofte kasseres under kirurgiske prosedyrer. Innledende kvantitative studier av voksne menneskelige hjerteaksjonspotensialer og ionisk currents ansatt enzymatisk isolerte atrial celler ^1-4. Opptak av aksjonspotensialer eller strøm fra isolerte voksent menneske ventrikulære celler har blitt videre rapportert ^3,5-10. De fleste av disse undersøkelsene har brukt celler oppnådd fra eksplanterte hjerter og utnyttes enten kollagenase perfusjon av koronar segment eller eksponering av relativt store mengder av utskåret vev til kollagenase for å oppnå isolerte celler. Disse studiene tillatt en detaljert karakterisering av et antall transmembrane ion strømmer fra menneskelige ventrikkel kardiomyocytter fra sunt hjerte og fra pasienter med terminal hjertesvikt. Opptak av L-type Ca ^{2 +} strøm (I _CA-L) ^5-7, forbigående utover kalium strøm _(jeg) ^8, innover liker kalium strøm (Jeg _κ1) ^8, de ulike komponentene av forsinket likeretter kalium strøm (Jeg _κ ) ⁹ er rapportert. Fremskritt og raffinering avisoleringsprosedyre ^10, tillates en klar karakterisering av ionisk basis av den økte arytmogene potensial i terminal hjertesvikt, som omfatter aksjonspotensial-forlengelse ^11, forsinket etter depolariseringer ¹² og økt morsom strøm ¹³ som fører til depolarisering diastolisk og premature slag.

Voksen hjertemuskelceller er normalt isolert fra små dyr ved retrograd perfusjon av hele hjertet med ulike enzymblandinger, en teknikk som gir høy avkastning av Ca ^{2 +-tolerante} celler ^14. Isolering av hjertemuskelceller fra fragmenter av vev er iboende mindre vellykket trolig på grunn av den begrensede tilgangen av enzymer til individuelle myocytes sammenlignet med det som oppnås ved perfusjon av koronararteriene. På grunn av den svært begrensede tilgjengeligheten av ubrukte donor hjerter, den eneste praktiske måten å få normale menneskelige ventrikulære celler på en jevnlig basis er ved enzymatisk digestion av de ofte svært små vev fragmenter skåret under elektive kirurgiske prosedyrer. Bare human sykdom modell som har blitt grundig karakterisert på cellenivå er terminal hjertesvikt, på grunn av tilgjengelighet til transplanterte hjerter. Imidlertid oppstår terminal hjertesvikt i et mindretall av pasientene og ofte innebærer en felles vei av alvorlig ombygging av hjerteinfarkt celler, noe som er relativt uavhengig av den underliggende årsaken ^15. Evnen til å vurdere funksjonen av enkelt kardiomyocytter fra pasienter på et tidligere ikke-sviktende stadium av sykdommen er viktig for å forstå de spesifikke patofysiologien til forskjellige arvede eller ervervede forhold. Hypertrofisk kardiomyopati (HCM) er et talende eksempel. HCM er en vanlig (1/500 individer) arvelig hjerte tilstand karakterisert ved hjertestans hypertrofi, økt arytmogene risiko og kontraktile forandringer på grunn av utstrømningen tarmkanalen obstruksjon og diastolisk dysfunksjon ^16. Cardiomyocytes fra HCM hjerter undergo en kompleks remodeling prosesser med endringer i cellestruktur (hypertrofi, myofibrillære uorden) og EF-Coupling ^17. Imidlertid har de fleste av informasjon myocyte dysfunksjon i HCM kommer fra transgene dyremodeller. Siden bare et mindretall av HCM pasienter utvikler seg mot terminal hjertesvikt og krever hjertetransplantert, HCM hjerter er svært sjelden tilgjengelig for celleisolasjon med standard metoder. Men minst 30% av HCM pasienter utvikle obstruktive symptomer på grunn av massive septal hypertrofi endring utstrømningen tarmkanalen blodstrømmen under systole (HCM) ^18. Den mest effektive tilgjengelige terapeutisk alternativ for lindring av obstruksjon i HCM er kirurgisk septal myectomy: i løpet av denne kirurgiske prosedyren, er en variabel størrelse del av øvre septum fjernet av trans aortic tilnærming. Denne delen av hypertrophied septum er derfor tilgjengelig for celleisolasjon fra den friske vev.

En fremgangsmåte for isolering av humant ventricular myocytes fra enkle, små transvenøse endomyokardbiopsi eksemplarer er tidligere utviklet og utgitt ^19. Vi gjennomførte en metode for å isolere enkelt septal myocytes fra ventrikulære myokard prøver fra pasienter som gjennomgår hjertekirurgi, inkludert pasienter med HCM gjennomgår septal myectomy og pasienter som gjennomgår ventil erstatning prosedyrer. I tillegg til en detaljert beskrivelse av isolasjonsprotokoll, representativ elektrofysiologisk og Ca ^{2 +} fluorescens målingene er presentert, som viser levedyktigheten til de isolerte humane ventrikulære myocytter, og gjennomførbarheten av patch clamp-og intracellulære Ca ^{2 +-studier.}

Protocol

De eksperimentelle protokoller på menneskelig vev ble godkjent av etisk komité av Careggi Universitet-Hospital (2006/0024713, fornyet mai 2009). Hver pasient ga skriftlig informert samtykke. En. Solutions og utstyr Forberedelse Løsninger er beskrevet i tabell 1.. Et forenklet flytskjema for cellen isolasjonsprosedyren er funnet i figur 1. Oppløsni…

Representative Results

Metoden beskrevet ovenfor ble anvendt for å karakterisere de funksjonelle forandringer av kardiomyocytter isolert fra septum av pasienter med hypertrofisk kardiomyopati (HCM) som gjennomgikk myectomy drift, sammenlignet med ikke-sviktende uten hypertrofiske kirurgiske pasienter 21. Resultatene i dette avsnitt er utledet fra det arbeidet 21, og er her vist som et eksempel på hvordan denne teknikken kan brukes til å karakterisere endringer av myokardial cellefunksjon hos hjertesykdomstilstander. <…

Discussion

Vi har beskrevet og validert en metode for å isolere levedyktige myocytes fra kirurgiske prøver av menneskelig ventrikkel myokard. Starter fra tidligere beskrevet protokoller som hadde blitt brukt til isolerte celler fra atrial kirurgiske prøver, teknikken for å tillate utskilling av enkeltlevedyktige myocytes fra sykelig ventrikkel myokard ble utviklet og finjustert. Tidlige rapporter viste at isolering av enkelt cardiomyocytes fra biter av atrial og ventrikulær vev selektivt svekket repolarizing kaliumstrøm, noe…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods