Summary
Современные знания на клеточном основе сердечных заболеваний в основном опирается на исследования на моделях животных. Здесь мы опишем и проверить новый метод для получения одного жизнеспособного кардиомиоциты от небольших хирургических образцах миокарда человека желудочка. Миоциты человека желудочковая могут быть использованы для электрофизиологических исследований и тестирования на наркотики.
Abstract
Кардиомиоциты от больных сердец подвергаются сложных ремоделирования процессов, связанных с изменениями в структуре клеток, сокращение возбуждения муфты и мембраны ионных токов. Эти изменения, вероятно, будут ответственны за увеличение аритмогенного риска и сократительных изменений, ведущих к систолического и диастолического дисфункции у кардиологических больных. Тем не менее, большая часть информации об изменениях функции миоцитов при кардиологических заболеваниях пришел из животных моделей.
Здесь мы опишем и проверить протокол для изоляции жизнеспособных миоцитов от небольших хирургических образцах миокарда желудочков у пациентов, перенесших операции на сердце операции. Протокол описан подробно. Электрофизиологические и внутриклеточных измерений кальция, как сообщается, продемонстрировать возможность ряда измерений одиночных клеток в кардиомиоциты желудочков человека, полученных с помощью этого метода.
Протокол сообщил онповторно может быть полезно для будущих исследований в области клеточной и молекулярной основе функциональных изменений человеческого сердца в присутствии различных сердечных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации новых терапевтических целей на клеточном уровне и для проверки эффективности новых соединений на кардиомиоцитов человека, с прямым поступательного стоимости.
Introduction
Рассечение электрофизиологических свойств миокарда прогрессировала заметно после разработки методов для одной изоляции сердечной миоцитов. Последние достижения в понимании сердечной возбуждения сжимающих Муфта (ИС-связь) также стало возможным благодаря способности изоляции жизнеспособных одиночных кардиомиоцитов, которые сохраняют все физиологические свойства неповрежденной ткани. Регулярно используются методы патч зажим для изучения функции и фармакологической модуляции сердечного сарколемных ионных токов. Записи динамики внутриклеточного кальция с Са 2 + чувствительных красителей также регулярно выступал на отдельных кардиомиоцитов из различных здоровых и больных моделей, предоставляя жизненно важные данные о физиологии EC-муфтой, а также на патологических изменений внутриклеточного Ca 2 + гомеостаз приводит к механической обесценение и повышенной аритмогенного бремени при кардиологических заболеваниях. InformaТион из этих исследований имеет решающее значение для понимания электрофизиологические и механические эффекты препаратов в клинических условиях. Однако есть виды характерные отличия в трансмембранных токов и в белках EC-Голова, на которые приходится особенностей потенциала сердечной действий и сердечных механики. Таким образом, в то время как исследования миоцитов изолированных от не человека млекопитающих выяснена биофизические свойства и физиологические роли конкретных трансмембранных ионных каналов и EC-Голова белков, они не обязательно предоставлять соответствующие модели кардиомиоцитов человека. Выделение жизнеспособных миоцитов из миокарда человека Поэтому крайне важно, чтобы в полной мере понять патофизиологии заболеваний сердца и утвердить новые терапевтические подходы.
Человеком предсердий ткань легко доступна как ушек предсердий часто отбрасывается во время хирургических процедур. Первоначальные количественные исследования взрослого человека потенциалов сердца действий и ионной у.е.rrents занятых ферментативно изолированный: мерцательная ячеек 1-4. Записи потенциалов действия или токов от отдельных взрослых желудочковой клеток человека были впоследствии сообщил 3,5-10. Большинство из этих исследований использовали клетки, полученные из эксплантированных сердца и используемые либо коллагеназы перфузии сегмента коронарной артерии или воздействием относительно большого количества вырезанной ткани коллагеназы, чтобы получить изолированных клеток. Эти исследования позволили подробную характеристику ряда трансмембранных ионных токов от желудочковой кардиомиоцитов человека от здоровых сердец и от пациентов с терминальной сердечной недостаточности. Записи L-типа Са 2 + ток (Я Ca-L) 5-7, переходный ток наружу калия (я к) 8, внутрь выпрямителя тока калия (Я κ1) 8, различные компоненты замедленного выпрямителя тока калия (Я κ ) 9 поступало. Авансы и переработкапроцедура изоляции 10, позволило четко охарактеризовать ионной основе возросшей аритмогенного потенциала в терминальной сердечной недостаточности, содержащей потенциала действия продление 11, задержка после деполяризаций 12 и увеличился смешное текущий 13 приводит к диастолической деполяризации и экстрасистол.
Взрослые кардиомиоцитов, как правило, изолированы от мелких животных по ретроградной перфузии всем сердцем с различными смесей ферментов, техника, которая производит высокие урожаи Ca 2 +-толерантных клеток 14. Выделение кардиомиоцитов из фрагментов ткани по своей сути менее успешным, вероятно, из-за ограниченного доступа ферментов в отдельных миоцитов по сравнению с, что достигается за счет перфузии коронарных артерий. Из-за очень ограниченного наличия неиспользованных доноров сердца, единственный практический способ получить нормальные человеческие желудочков клетки на регулярной основе является путем ферментативного digestioн из часто очень небольших фрагментов ткани, вырезанных во время плановых хирургических процедур. Единственная модель болезни человека, который был тщательно характеризуется на клеточном уровне является терминал сердечная недостаточность, из-за доступности пересаженных сердец. Тем не менее, терминал сердечная недостаточность возникает в меньшинстве пациентов и часто включает в себя общий путь тяжелой ремоделирования клеток миокарда, которая является относительно независимым от основной причины 15. Возможность оценить функцию отдельных кардиомиоцитов из пациентов на более ранней, не сбой стадии заболевания важно понять конкретную патофизиологии различных наследственных или приобретенных условиях. Гипертрофическая кардиомиопатия (HCM) является показательным примером. НСМ является общим (1/500 человек) по наследству сердечной состояние, характеризующееся гипертрофии сердца, повышенное аритмогенных риска и сократительные изменений вследствие обструкции выходного тракта и диастолической дисфункции 16. Кардиомиоцитов из HCM сердцах уndergo достаточно сложные ремоделирования процессы с участием изменения в структуре клеток (гипертрофия, миофибриллярный беспорядок) и EC-муфта 17. Тем не менее, большая часть информации из миоцитов дисфункции у HCM пришел из трансгенных животных моделях. Поскольку только меньшинство пациентов HCM развивается в сторону терминальной сердечной недостаточности и требует трансплантации сердца, HCM сердца очень редко доступны для выделения клеток со стандартными методами. Тем не менее, по крайней мере, 30% пациентов HCM развивать симптомы обструкции из-за массивного притока крови гипертрофия перегородки изменяющие выносящего тракта во время систолы (HCM) 18. Наиболее эффективным доступны терапевтический вариант для облегчения обструкции в HCM является хирургическое перегородки myectomy: во время этой хирургической процедуры, переменная размера часть верхней перегородки удаляют транс аорты подхода. Эта часть гипертрофированной перегородки Поэтому для выделения клеток из свежей ткани.
Способ выделения человеческого ventriculaг миоциты с одного, малых трансвенозной эндомиокардиальной биопсии был ранее разработан и опубликован 19. Мы реализовали метод, чтобы изолировать одиночные септальные миоциты из образцов миокарда желудочков у пациентов, перенесших операцию на сердце, в том числе пациентов с HCM, проходящих перегородки myectomy и пациентов, перенесших процедуры замены клапана. В дополнение к подробным описанием протокола изоляции, представитель электрофизиологических и Са 2 + флуоресценции измерения представлены, демонстрируя жизнеспособность изолированных желудочковых миоцитов человека и возможности патч зажима и внутриклеточных Са 2 + исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные протоколы о человеческой ткани были одобрены этическим комитетом Кареджи University-больницы (2006/0024713; обновляется мая 2009 года). Каждый пациент дали письменное информированное согласие.
1. Решения и Подготовка оборудования
Решения, описаны в таблице 1. Упрощенная схема последовательности операций процедуры выделения ячейка найдена на рисунке 1.
| Решение | СР | DB | КБ | ТБ | PS | EB1 | EB2 | |
| Реагент (мМ) | KH 2 PO 4 | 50 | ||||||
| MgSO 4 | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | |||||
| аденозин | 5 | |||||||
| глюкоза | 140 | 10 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
| маннитол | 100 | |||||||
| таурин | 10 | 20 | 5 | 20 | 20 | |||
| NaCl | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
| KCl | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
| MgCl 2 | </ TD> | 1.2 | 5 | |||||
| KH 2 PO 4 | 0,6 | 30 | 0,6 | 0,6 | ||||
| Na 2 HPO 4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | |||||
| NaHCO 3 | 12 | 12 | 12 | |||||
| КНСО3 | 10 | 10 | 10 | |||||
| Na-пируват | 4 | 4 | 4 | |||||
| BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
| BHBA | 5 </ TD> | |||||||
| янтарная кислота | 5 | |||||||
| ЭГТА | 0.5 | |||||||
| К 2-АТФ | 2 | |||||||
| пировиноградная кислота | 5 | |||||||
| креатин | 5 | |||||||
| KMES | 115 | |||||||
| Ферменты (U / мл) | Коллагеназы типа V | 250 </ TD> | 250 | |||||
| Протеазы Тип XXIV | 4 | |||||||
| рН | 7.4 КОН | 7.3 NaOH | 7.1 КОН | 7.35 NaOH | 7.2 КОН | 7.3 NaOH | 7.3 NaOH | |
Таблица 1. Решения, используемые для сбора образцов мокроты, выделения клеток и функциональной характеристике миоцитов CP = кардиоплегический решения.; DB = диссоциации буфера; КБ = решение Крафт-Bruhe; ТБ = Тироде буфера; PS = пипетки решение; EB1 = фермент буфер 1; EB2 = фермент буфер 2.
- Подготовка кардиоплегический (СР) решение. CP раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 недели.
- Подготовка Ca 2 +-бесплатно диссоциации буфера (DB). Это решение следует использовать в течение дня.
- Подготовка Крафт-Bruhe (КБ) решение. Решение КБ можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 пик.
- Подготовка Ca 2 +-свободный буфер Тироде (ТБ). Это решение следует использовать в течение дня.
- Фильтр все решения с использованием шприцев фильтры перед использованием.
- Подготовьте пищеварения устройство (рис. 2), очищая контейнер из двух лицевых щеток силиконового эластомера, одна из которых вращают на электродвигатель. Переваривание устройство на заказ. Подробности на пищеварение прибора находятся в рисунке 8; образы прибора находятся в рисунках 2 C и 2D. Вымойте тканей камеру с 70% этанола и воды.
2. Сбор и обработка инфаркт образцов
- Налейте 40 мл cardiplegic (СР) растворе в 50 мл трубки и хранить его в лед для образца транспортировки от оперативного комнаты в лаборатории изоляторе.
- Соберите желудочка миокарда образец из оперативной комнате сразу после удаления, промойте его ледянойРешение СР и хранить его в трубке. Использование эндокарда образцы вырезают из верхнего межжелудочковой перегородки в течение операции на открытом сердце, взвешивание> 100 мг.
- Быстро передавайте образца в область лаборатории; начать обработку образца в течение 10 мин от образца удаления.
- Сохраняя образца в ледяной CP буфера, аккуратно снимите эндокарда фиброзной слой с помощью тонких ножниц под стереомикроскопом; после этого, отрезать ткань миокарда на мелкие кусочки (длиной 2-3 мм). В зависимости от размера выборки ткани, вырезать на общую сумму миокарда желудочков между 100 мг и 1 г для каждого изоляции.
- После завершения ткани измельчения, перенести инфаркты куски в пищеварения устройства, с чистым льдом холодный раствор CP. Не заполняйте весь объем между двумя кремниевыми щеток (3-4 мл) с инфарктом куски, используя не более 1 г общей ткани.
3. Стиральная и Переваривание инфаркта Куски
- Кормовойэ куски передаются в выскабливание палаты пищеварения устройства измените буфер CP в камере с холодным Ca 2 + свободного буфера диссоциации (БД).
- Поместите пищеварения устройство в термостатической ванне, для того камеру, чтобы быть в контакте с нагретой воды в ванне (рис. 1). Установка ванны до 37,5 ° С и включить его, с тем чтобы медленно повышения температуры тканей камеры. Включите мотора пищеварения устройства, установка скорости вращения на 1 оборот / секунду.
- Выполните 3 цикла стирки с БД, изменяя решение в камере с чистой БД каждые 8 мин. DB нагревают (37 ° C) и насыщенным кислородом, прежде чем в контакте с инфарктом куски.
- Подготовка фермента буфера 1 (EB1) добавлением 250 ед / мл коллагеназы типа V и 4 ед / мл протеазы типа XXIV в растворе DB. Подготовка фермента буфер 2 (Eb2) добавлением 250 ед / мл коллагеназы типа V к решению DB. Разминка (37 ° C) и oxygenatэ EB1 и EB2.
- Выполнение двух циклов 12 мин пищеварения во вращающейся пищеварения устройства со 100% кислородом EB1 (при 37 ° С). В каждом цикле, используйте ~ 3 мл EB1. Снимите решение, пипетки стремления и выбросьте его после каждого цикла.
- Подготовка 6 15 мл пробирки для сбора клеток и ~ 80 мл холодного (4 ° C) KB раствора для элюирования буферы.
- Выполните первые 15 мин пищеварения цикл с 3 мл 100% кислородом EB2 при 37 ° С После цикла варки, собирают раствор, содержащий первую разложенных миоцитов в 15 мл пробирку и разбавленной клеточной суспензии с 12 мл холодного раствора KB. Храните трубы квартиру при комнатной температуре.
- Развести оставшийся раствор Eb2 с равным количеством БД, с тем чтобы сократить вдвое концентрацию коллагеназы V для следующих циклов пищеварение.
- Выполнение других циклов 5 12 мин гидролиза с 3 мл EB2 при 37 ° С; после каждого из них собирают из миоцитов, содержащей буфер, в 15 мл коническую пробирку иразбавить его с 12 мл раствора KB. Храните 6 ячеек, содержащий трубки при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Ресуспендирование сотовый и Са 2 + реадаптации
- Добавить 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 20 мл Ca 2 +-буфере Тирода (TB). Фильтр решение.
- Центрифуга шесть миоцитов содержащие конические пробирки при 100 мкг в течение 5 мин, чтобы заставить миоцитов по урегулированию. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в каждую пробирку с переменным количеством (1-3 мл, в зависимости от выход) BSA, содержащем ТБ при комнатной температуре.
- Постепенно увеличивайте концентрации Са 2 + в клеточной содержащий буфер путем добавления небольших аликвот 100 ммоль / л CaCl 2 решения. В первом и втором этапах Ca 2 + концентрация повышается до 50 мкмоль / л и 100 мкмоль / л, соответственно. Следующие Ca 2 +-аддитивные этапы выполняются каждые 5 мин и концентрации увеличивается на 100 мкмоль / л на каждом шаге тО.А. конечная концентрация 0,9 ммоль / л
- Оценка урожайности процедуры выделения. Передача 0,5 мл раствора, содержащего миоцитов на стеклянную нижнюю камеру микроскопа. Оценка 15 микроскопа поля на 10-кратным увеличением и объективной вычислить процент здоровых миоцитов (например, стержневые клетки с четкими страт и без значительных включений, рисунок 2). Ожидаемая доходность составляет около 20%.
5. Функциональная оценка изолированном кардиомиоцитов.
Следующий протокол является примером человека кардиомиоцитов функциональной оценки, включая одновременной регистрации потенциалов действия и внутриклеточных Са 2 + потоков.
- Подготовка пипетки решение (PS) для патч зажим экспериментов в перфорированной конфигурации патч. Раствор можно хранить при температуре -20 ° С в течение до 3 месяцев.
- Добавить 1,8 ммоль / л CaCl 2 к Са 2 + без буферной Тироде (ТБ). Uсебе это решение для суперфузии кардиомиоцитов во время патч зажим / флуоресценции экспериментов.
- Передача 1 мл клеточной суспензии в 1,5 мл трубки и добавить 10 мкмоль / л Fluoforte и 10 мкл энергосети концентрат. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого, установите трубку в вертикальном положении и оставить клетку урегулировать в течение 5 мин; ресуспендирования клеток в Ca 2 +, содержащий ТБ.
- Передача 0,25 мл суспензии клеток к небольшой (0,5 мл), с контролем температуры микроскоп смонтированы записи камеру, орошали под действием силы тяжести с нагретой системы microperfusor при скорости потока 0,3 мл / мин (температура: 37 ± 0,5 ° С).
- Использование микропипетки съемник, подготовить патч зажим пипетки с диаметром кончика 3 до 5 мкм и сопротивления от 3 до 4,5 М при наполненной PS.
- Добавить амфотерицин В в пакет ПС (250 мкг / мл) и использовать его для заполнения электрода.
- Выберите стержневых ячейку с четкими страт, лишенный включений, FOгт печать гига и ждать от 5 до 10 мин, пока сопротивление доступа не ниже 20 МОм.
- Выявите потенциалов действия в текущем режиме зажим с помощью коротких импульсов (<3 мсек) при различных частотах стимуляции (0,2 Гц, 0,5 Гц и 1 Гц, 1 мин на каждой частоте). Во время фазы записи, включите ярком освещении поля на 492 ± 3 нм и обнаружения флуоресценции Fluoforte на 505-520 нм. Приобретать флуоресценции и мембранный потенциал сигналов с использованием DIGIDATA 1440A и pClamp 10,0 программного обеспечения. Повторите последовательность записи нескольких раз, если это необходимо; однако, иметь общее время записи ниже 15 мин для каждой ячейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный выше способ был использован для характеристики функциональных нарушений кардиомиоцитов, выделенных из межжелудочковой перегородки пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (НСМ), перенесших операции myectomy, по сравнению с не являющихся В противном случае гипертрофических хирургических больных 21. Результаты, содержащиеся в данном разделе, получена из этой работы 21 и показаны здесь в качестве примера того, как этот метод может быть использован для характеристики изменений функции клеток миокарда в условиях сердечных заболеваний.
Представитель хирургическое образец от пациента с HCM показано на рисунке 2А. Хирургические образцы были крайне переменная с точки зрения размера и толщины эндокардиальной волокнистой полосы. Количество ткани миокарда, что мы использовали для каждой процедуры изоляции из образцов HCM было около 1 г. Вместо этого, количество ткани используются для контрольных образцов был меньше (100-500 мг)., Из-за Лоуг наличие ткани. Выход был значительно выше, когда контрольные образцы были обработаны по отношению к ГКМ, вероятно потому что относительное количество жизнеспособных миокардиальных клеток в ткани уменьшается в НСМ миокарда и эндомиокардиальная фиброз увеличивается 22. Из этих наблюдений мы пришли к выводу, что необходимое количество ткани для получения жизнеспособных клеток может быть переменной в зависимости от отсутствия или наличия инфаркта болезни.
Образцы нарезать небольшими кусочками, как показано на рисунке 2B. После этого куски переносили в камере пищеварения устройства (рис. 2в) и используется для изоляции одной клетки, как описано выше (фиг. 2D). Типичные микрофотографии суспензии клеток, полученной с использованием описанной процедуры выделения клеток из межжелудочковой перегородки образца показана на фиг.3А и 3В; увеличенные изображения одного желудочка окrdiomyocytes изображены на рисунках 3C-3F. Кардиомиоциты из образцов HCM были использованы для одновременной регистрации потенциалов действия и внутриклеточных Са 2 + вариаций, как описано в разделе протокола. Типичные одновременных следы показывающие мембраны напряжения (см. выше) и внутриклеточного Са 2 + (см. ниже) во время стимуляции на три разных частотах показаны на рисунке 4: эти следы были записаны с одного кардиомиоцитов, выделенных из образца НСМ.
Результаты патч зажим исследований показали, что потенциал действия продолжительность (APD), записанные на различных частотах стимуляции заметно продлен в кардиомиоцитов из пациентов с HCM (HCM кардиомиоцитов) по сравнению с контрольной (рис. 5а и 5б). Для выяснения поддержание физиологических реакций в изолированных миоцитов, мы проверили эффекты изопротеренолом, используется в 10 - 7 М (рис. 5C): β-adrenerГПК стимуляция производится ожидаемого AP сокращение в контрольных миоцитов. Поскольку длительное APD приводит к повышенному риску в ранние сроки после depolarisations (EADS) 23, появление EADS, обнаружены как спонтанные depolarisations во время фазы плато АП, была измерена. В HCM кардиомиоцитов, EADS были значительно более частыми по сравнению с контрольной группой (рис. 5, г). Представитель след, показывающий несколько EADS показан на рисунке 5E
Для проверки того, более длинные APD и ионного тока нарушения могут повлиять механизмы возбуждения-сжатия муфты в HCM кардиомиоцитов, свойства внутриклеточных Са 2 + вариаций были оценены во время стимуляции. Амплитуда Са 2 + переходных вызывали в условиях ток-зажим были подобны в HCM сравнению с контрольными кардиомиоцитов (рис. 6а). И наоборот, кинетика Ca 2 + переходных, были значительно больше в HCM (рис.6B). Кроме того, внутриклеточный диастолическое Са 2 + концентрация была заметно выше в HCM сравнению с контрольными кардиомиоцитов (рис. 6, в) и увеличился более заметно при увеличении частоты стимуляции.
Следует отметить, что выделенные кардиомиоциты с помощью этого метода из образцов человека желудочковых также успешно применяться для других приложений, в том числе фиксации потенциала записи конкретных трансмембранных токов (рис. 7А), внутриклеточный Ca 2 + и / или клетка сокращения записи при электрической стимуляции поля (рис. 7Б) и оценка тонкой структуры сарколемме помощью конфокальной микроскопии и мембраной флуоресцентные метки (рис. 7в).
Рисунок 1. Блок-схема процедуры выделения клеток.
Рисунок 2. Обработка образцов желудочковых для выделения клеток. (A) представитель изображение, показывающее образец миокарда желудочков у пациента с ГКМ, которые подверглись операции перегородки myectomy. Калибровка бар = 5мм. (В) Куски желудочка разреза тканей у желудочковой хирургических образца, которые будут использоваться для выделения клеток. Калибровка бар = 5мм. (C) Образы пищеварения устройства. Устройство содержит камеру пищеварения с двух кремниевых щеток: Улучшенный щетка может вращаться при перемещении в действие двигателем (D) На рисунке показана пищеварения устройство в термостатируемой бане при ферментативном переваривании желудочка ткани.. р>
Рисунок 3. Изолированные человеком желудочковая кардиомиоциты. (АВ) Панель представлены микрофотографии двух полей микроскоп (10x объективных) Показаны репрезентативные суспензий кардиомиоцитов. Следует отметить, что около 30% клеток стержневых и показать четкие страты. Калибровка бар = 100 мкм. (CE) Типичные изображения 3 кардиомиоцитов человека, выделенных из образце больного HCM (40x цель). Калибровка бар = 20 мкм. (F) Изображение показывает человека кардиомиоцитов желудочков затронуты кончике патч пипетки для записей. Калибровка бар = 20 мкм.
ES.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Одновременная запись мембранного потенциала и внутриклеточного кальция. Представитель след показывая мембранного потенциала (выше) и внутриклеточный кальций (ниже), записанные с одного миоцита, выделенной из образца HCM. Миоцит стимулируется с помощью патч-пипетки на 0,2 Гц, 0,5 Гц и 1 Гц.
Рисунок 5. Изменения потенциалов действия в желудочковой кардиомиоцитов из образцов HCM. (А) представитель накладывается потенциалы действия вызвали на 0,2 Гц, 0,5 Гц и 1 Гц от управления миоцита (слева, серых следов) и миоцита HCM (правый, черный следы ). (Б) Средний потенциала действия при 90% реполяризации (APD90%) в HCM (п = 81) иуправления кардиомиоциты (п = 29) в трех ходивших частот испытания. (С) Появление EADS в кардиомиоцитов из пациентов HCM и контрольных образцов. (D) накладывается потенциалы действия в 0,5 Гц от управления миоцита в отсутствие (непрерывная запись) и в присутствии 10 -7 М изопротеренола. (Е) представитель след показывая мембранный потенциал кардиомиоцитов от больного HCM отображаются несколько спонтанных деполяризаций происходящие во время фазы плато (начало после деполяризаций, EADS), отмеченные стрелками. Стимулы отмечены коротких линий ниже следа. ** = Р <0,01 непарный т-тест. Все панели на рисунке изменены с разрешения Коппини и соавт. 2012 21.
Фигура6. Изменения переходных кальция в желудочковой кардиомиоцитов из образцов HCM. (А) представитель накладывается переходные кальция вызывали во время стимуляции в 0,2 Гц через патч пипетки в контрольной миоцита (серый) и клеток HCM (черный). Примечательно, что амплитуда Са 2 + переходных не отличается между двумя ячейками (B) кинетика Са 2 + переходных процессов в HCM (N = 42) и контроль (N = 24) кардиомиоциты:. Время от стимула до пика переходный (TP ), время от пика до 50% распада (T50%) и времени от пика до 90% распада переходного (T90%) показаны. (С) Представительства длинные следы, показывающие внутриклеточного Са 2 + во время стимуляции в 3-х различных частотах в HCM и управления миоциты, подчеркивая возросшую диастолическое Са 2 + при высоких скоростях стимуляции в миоцита HCM. (D) Средний диастолическое Са 2 + в HCM (п = 42) и контрольную (п = 24) кардиомиоциты в 3-х различных стимуляции раTES. ** = Р <0,01 непарный т тест. Все панели на рисунке изменены с разрешения Коппини и соавт. 2012 21.
.. Рисунок 7 Дополнительные экспериментальные приложения, использующие желудочковых миоцитов человека (A) Слева: представитель накладывается следы, свидетельствующие L-типа Ca 2 + ток записан под зажим напряжения при различных напряжениях мембранных с определенным протоколом (см. 21 для деталей). Справа: средняя L-типа Ca 2 + пиковый ток плотностью от 18 клеток, выделенных из образцов HCM в разное мембраны. Напряжения. (В) внутриклеточного Са 2 + проследить записан с желудочковой миоцита при электрической стимуляции поля на 1 Гц. (С) конфокальной образ желудочка cardiomyocyte из образца НСМ окрашенных флуоресцентным красителем связанный с мембраной (ди-3-ANEPPDHQ). Следует отметить, что плотность ttubules низкий, предполагая, морфологический мембраны ремоделирования в HCM.
Рисунок 8. Переваривание устройство. (АВ) Компоненты пищеварения устройства. Вращающийся двигатель с регулируемой скоростью подключен к первому пластиковому рычага, который подключен к второму. Второй пластиковый рукав является съемным и соединен с верхней щетки. Щетки выполнены с силиконового эластомера. ПТФЭ отрицательный плесень, с 100 отверстиями расположенными ~ 1,5 мм был использован, чтобы бросить кисти из жидкого силикона. Внутреннее пространство пресс-формы имеет 1,9 см в диаметре и толщиной 6 мм, производя щетки одного и того же размера. Отверстия расположены на одной стороне кристаллизатора выполнены с целью получения 8 мм длиной щетины, когда щеткиотлиты и извлекают из формы. После того, как жидкий силикон помещают в пресс-форму, по меньшей мере, 48 ч, необходимых для полного отверждения. Щетки установлены внутри стеклянной трубки (внутренний диаметр = 2 см, толщина 2 мм) и цилиндрическая камера, образованна двум щетками и стеклянные стенки герметично уплотнен двумя резиновыми уплотнительными кольцами. Щетки должны быть толкнул одного в другой; нижний приклеен на пластиковой основе, в то время как верхняя приклеивают к пластиковой конце рычага двигателя и, следовательно, способна вращаться. (C) Увеличенный вид верхней щетки. Следует отметить, что кисть должна быть приклеены к концу рычага двигателя, для того чтобы повернуть (D) Компоненты камеры показаны в их конечное положение. Пространство между двумя щетками (фактическое камеры) составляет ~ 2 см в ширину и 7-8 мм в высоту; это пространство легко помещается 3-4 мл буфера, кроме до 1 г ткани миокарда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали и утверждена метод, чтобы изолировать жизнеспособные миоциты от хирургических образцах миокарда человека желудочка. Начиная с описанными ранее протоколов, которые были успешно использованы для изолированных клеток от предсердий хирургических образцов, техники, чтобы позволить разделение отдельных жизнеспособных миоцитов от больного миокарда желудочков была разработана и точно выверенных. Первые сообщения показали, что изоляция отдельных кардиомиоцитов из кусков предсердий и желудочков ткани избирательно нарушениями repolarizing калиевых токов, что приводит к измененным электрофизиологических свойств и ответов на физиологическом стимулов 8,24, в то время как поставки фермента, содержащего буфер с помощью коронарной перфузии не ухудшить задержкой выпрямитель токи в выделения клеток 25. К сожалению, изоляция желудочковых миоцитов человека от хирургических образцах миокарда желудочков не может быть выполнена коронарной перфузии с целостности коронарных ветвейтеряется, в противоречии с эксплантированных сердцах. Кардиомиоциты выделенные из миокарда куски, используя наш метод отображения четкую адаптацию потенциала действия в ответ на изменения частоты стимуляции или β адренергической стимуляции. Для того, чтобы таких ответов на происходят, целостность задержанных каналов выпрямитель калия требуется 26-28, что указывает на общую целостность этих каналов не ведет к снижению нашего метода изоляции. Кроме того, клетки, выделенные с нашими методами показать не только регулярные электрофизиологические ответы (3 и 4), но и показать кальция переходные процессы ожидаемого формы и длительности (рис. 3 и 5) и регулярные саркомерный организацию (рис. 2) и сокращая свойства (не показаны), предполагая, что общая структурная целостность этих клетках сохраняется этой процедуры выделения. Основной продвижение этого метода по сравнению с предыдущимМетоды обеспечивается новой конструкции пищеварения устройства, которая обеспечивает мягкое механическое перемешивание тканевых куски, позволяя разделение одной клетки без чрезмерного ущерба. Кроме того, использование устройства пищеварения позволило использовать более низкую концентрацию ферментов в буфере изолятор; в частности мы используем гораздо меньшую концентрацию неизбирательного протеазы по сравнению с ранее известными способами 24. Устройство выполнено на заказ в нашей лаборатории: строительные схемы представлены на рисунке 8.
Простая конструкция и структура делает его очень легко воспроизвести для успешного завершения этого протокола. Легенда рисунок 8 также описываются процедуры, необходимые для производства силиконовых кисти и строительство выскабливание камеру. Вследствие преимуществ пищеварения устройства, относительно высокое количество жизнеспособных клеток может быть получена из относительно малого количества желудочковой ткани (как низко как 100 мг).Способ ранее опубликована 19 было показано, чтобы обеспечить кальция толерантных миоциты от небольших биопсий (даже <20 мг). Тем не менее, сообщил выход миоцит была очень низкой и авторы не показали, были ли клетки, выделенные с этим методом возможно для характеристики внутриклеточного велосипеде кальция и сократительной функции. Этот метод потенциально применима ко многим хирургических больных, поскольку небольшие порции межжелудочковой перегородки часто вырезали во время процедуры замены клапана (замены аортального клапана например.). Тем не менее, ключевым моментом для получения успешного изоляции является быстрое начало процедуры после отбора проб из операционной. Таким образом, это необходимо для клеточной лаборатории, чтобы быть в непосредственной близости от кардиохирургии клиники, для того, чтобы эту технику, чтобы быть плодотворным. Кроме того, надлежащая активность фермента также чрезвычайно важным для успешного изоляции. Поскольку неизбирательного активность протеазы ое каждый коллагеназы партия, как правило, не совсем испытания, каждая партия, скорее всего, работать по-другому во время выделения клеток. Поэтому очень важно, чтобы точно настроить конечная концентрация коллагеназы в целях достижения лучших результатов. Мы предлагаем наблюдая клеточной суспензии под микроскопом в каждом цикле, для того, чтобы быть уверенным, что жизнеспособные клетки начинают появляться в цикле 3 Раннее появление клеток предполагает чрезмерное активность фермента и предлагает к снижению концентрации фермента.; Появление клеток после цикла 3 предполагает недостаточную активность фермента. По нашему опыту, это является наиболее эффективным показателем правильной концентрации фермента.
Мы успешно использовали этот метод для получения одиночных кардиомиоцитов из меж-желудочковой перегородки пациентов HCM с желудочка отток обструкции левого тракта прохождения хирургического перегородки myectomy, а также от не-В противном случае, не гипертрофических хирургических больных 21. Результаты этой работыпоказывают, что миоциты, выделенные с помощью этого метода можно использовать для полной оценки электрофизиологического с методами патч зажим, одновременно оценки EC-муфты аномалии, путем записи внутриклеточной динамики кальция с флуоресцентными красителями. Процедура записи здесь описано позволило собрать несколько физиологических параметров ячейка с одной записи с каждой ячейки, таким образом производя большое количество данных с ограниченным числом клеток и образцов. Благодаря этим преимуществам, этот метод успешно используется для характеристики конкретных функциональных аномалии желудочковой кардиомиоцитов из пациентов HCM, по сравнению с не гипертрофических пациентов 21. Аномалии ионных токов и продолжительности потенциала действия, а также кинетических аномалий од внутриклеточного Са 2 + на велосипеде были четко определены с помощью этой техники, с высокой воспроизводимостью. Кроме того, мы показали, что лечение с селективным ингибитором Na + конце Vs. плацебо у пациентов с HCM 29, который в настоящее время продолжается.
Человеческих наличие сердечной образец относительно невелик, даже в специализированных центрах, и это может ограничить широкое применение этой методики. Тем не менее, качество информации, которые могут быть непосредственно полученного из образцов пациентов на болезнь, связанная изменений в функции кардиомиоцитов сравнима с достижимыми от животных моделях HCM и других сердечных заболеваний. Учитывая обширные различия междуфизиология человека и мыши кардиомиоцитов, данные из функциональной оценки человека миоцитов может быть чрезвычайно ценным. Как заключение, мы считаем, что будущие приложения этой техники может внести значительный вклад в знания сердечных заболеваний, так как наш протокол обеспечивает возможность выполнять полный набор функциональных оценок непосредственно на клетки из образцов пациентов, с непосредственным значением трансляционного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ЕС (STREP проекта 241577 "Большое сердце", 7-й Европейской рамочной программы, CP), Menarini международных операций Люксембурге (AM), Телемарафон GGP07133 (СР) и Gilead Sciences (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |
References
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
- Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
- Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
- Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
- Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
- Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
- Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
- Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
- Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
- Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
- Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
- Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
- Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
- Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
- Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
- Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
- Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
- Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).
