Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover

Summary

Aktuell kunskap om den cellulära grunden för hjärtsjukdomar förlitar sig främst på studier av djurmodeller. Här beskriver vi och validera en ny metod för att erhålla enstaka livskraftiga hjärtmuskelceller från små kirurgiska prover av mänsklig ventrikulär hjärtmuskeln. Mänskliga ventrikulära myocyter kan användas för elektrofysiologiska studier och drogtestning.

Abstract

Cardiomyocytes från sjuka hjärtan utsätts för komplexa remodeling processer som innefattar förändringar i cellstrukturen, excitation kontraktion koppling och membran jonströmmar. Dessa förändringar kommer sannolikt att vara ansvarig för den ökade arytmogena risk och de kontraktila förändringar som leder till systolisk och diastolisk dysfunktion hos hjärtpatienter. Emellertid har mest information om de förändringar av myocyt funktion i hjärtsjukdomar kommer från djurmodeller.

Här beskriver vi och validera ett protokoll för att isolera livskraftiga myocyter från små kirurgiska prover av ventrikulär hjärtmuskeln från patienter som genomgår hjärtkirurgi verksamheten. Protokollet beskrivs i detalj. Elektrofysiologiska och intracellulära mätningar kalcium rapporteras att demonstrera genomförbarheten av ett antal encelliga mätningar i humana ventrikulära hjärtmuskelceller som erhålls med denna metod.

Protokollet rapporterade hanre kan vara till nytta för framtida undersökningar av den cellulära och molekylära grunden för funktionella förändringar av det mänskliga hjärtat i närvaro av olika hjärtsjukdomar. Vidare kan denna metod användas för att identifiera nya terapeutiska mål på cellnivå och för att testa effektiviteten av nya föreningar för mänskliga hjärtmuskelceller, med direkt translationell värde.

Introduction

Dissektion av de elektrofysiologiska egenskaperna hos hjärtmuskeln har utvecklats markant efter att utveckla tekniker för enkel hjärt myocyte isolering. Nya framsteg i förståelsen av hjärt-excitation Sammandragning Koppling (EG-Coupling) har också gjorts möjligt genom förmågan att isolera livskraftiga enstaka hjärtmuskelceller som har kvar alla de fysiologiska egenskaperna hos den intakta vävnaden. Patch-clamp-förfaranden är rutinmässigt används för att studera funktionen och farmakologisk modulering av kardiell sarcolemmal jonströmmar. Inspelningar av intracellulära kalciumdynamik med Ca ^{2 +-känsliga} färgämnen också regelbundet utförs på enskilda hjärtmyocyter från en mängd olika friska och sjuka modeller, som ger viktiga data om fysiologi EG-koppling samt på de patologiska förändringar av intracellulär ^{Ca2 +} homeostas leder till mekanisk försämring och ökad arytmogena börda i hjärtsjukdomar. Information från dessa studier är kritisk för att förstå de elektrofysiologiska och mekaniska effekter av läkemedel i klinisk miljö. Men det finns artspecifika skillnader i trans strömmarna och i EG-Coupling proteiner som står för särdrag hjärtats aktionspotential och hjärt mekanik. Medan studier av myocyter isolerade från icke-humana däggdjur har klargjort biofysikaliska egenskaper och fysiologiska roller specifika trans jonkanaler och EG-Coupling proteiner, de inte nödvändigtvis relevanta modeller för mänskliga hjärtmuskelceller. Isolering av livskraftiga myocyter från mänskliga hjärtmuskeln är därför viktigt att till fullo förstå patofysiologin av hjärtsjukdomar och validera nya terapeutiska metoder.

Human förmaksvävnad är lätt tillgänglig som förmaks bihang ofta kastas under kirurgiska ingrepp. Initiala kvantitativa studier av vuxna humana hjärtaktionspotentialer och joniska currents anställd enzymatiskt isolerade förmaks celler ^1-4. Inspelningar av aktionspotentialer eller strömmar från isolerade vuxna humana kammarceller har därefter rapporterats ^3,5-10. De flesta av dessa studier har använt celler från explanterade hjärtan och utnyttjade antingen kollagenas perfusion av ett kranskärl segment eller exponering av relativt stora mängder utskuren vävnad att kollagenas för att erhålla isolerade celler. Dessa studier får en detaljerad beskrivning av ett antal trans jonströmmar från humana ventrikulära hjärtmuskelceller från friska hjärtan och från patienter med terminal hjärtsvikt. Inspelningar av L-typ ^{Ca2 +} ström (I _Ca-L) ^5-7, övergående utåt kalium Ström _(jag) ^8, aktiv likriktare kaliumström (I _κ1) ^8, de olika komponenterna i fördröjd likriktare kaliumström (I _κ ) ⁹ har rapporterats. Förskott och förädling avisoleringsförfarandet ^10, får en tydlig karakterisering av den joniska grunden för ökad arytmogena potentialen i terminal hjärtsvikt, som består av aktionspotential förlängning ^11, försenas efter depolarisationer ¹² och ökad rolig ström ¹³ som leder till diastolisk depolarisering och prematura beats.

Vuxen hjärtmyocyter normalt isoleras från smådjur genom retrograd perfusion av hela hjärtat med olika enzymblandningar, en teknik som ger höga utbyten av Ca ^{2 +-toleranta} celler ^14. Isolering av hjärtmuskelceller från fragment av vävnad sin natur är mindre framgångsrik förmodligen på grund av den begränsade tillgången av enzymer till enskilda myocyter jämfört med den som uppnås genom perfusion av kranskärlen. På grund av den mycket begränsade tillgången på oanvända donor hjärtan, är det enda praktiska sättet att få normala mänskliga ventricular celler regelbundet genom enzymatisk digestion av de ofta mycket små vävnadsfragment utskurna vid elektiva kirurgiska ingrepp. Den enda modellen mänsklig sjukdom som har blivit grundligt karakteriseras på cellnivå är terminal hjärtsvikt på grund av tillgängligheten till transplanterade hjärtan. Dock förekommer terminal hjärtsvikt hos en minoritet av patienterna och innebär en gemensam väg för svår ombyggnad av hjärtmuskelceller, som är relativt oberoende av den bakomliggande orsaken ¹⁵ ofta. Förmågan att bedöma funktion av enstaka hjärtmuskelceller från patienter i ett tidigare icke misslyckas stadium av sjukdomen är avgörande för att förstå den specifika patofysiologi av olika ärftliga eller förvärvade förhållanden. Hypertrofisk kardiomyopati (HCM) är ett talande exempel. HCM är en vanlig (1/500 personer) ärftliga hjärt tillstånd som kännetecknas av hjärthypertrofi, ökat arytmogena förändringar risk-och sammandragande på grund av utflöde obstruktion och diastolisk dysfunktion ^16. Cardiomyocytes från HCM hjärtan undergo en komplex remodeling processer med förändringar i cellstruktur (hypertrofi, myofibrillar oordning) och EG-Koppling ^17. Emellertid har mest information om myocyt dysfunktion i HCM kommer från transgena djurmodeller. Eftersom endast en minoritet av HCM patienter utvecklas mot terminal hjärtsvikt och kräver hjärttransplantation, HCM hjärtan är mycket sällan tillgängliga för cellisolering med standardmetoder. Men minst 30% av HCM patienterna utvecklar obstruktiva symtom på grund av massiva septal hypertrofi förändra utflöde blodflödet under systole (HCM) ^18. Den mest effektiva tillgängliga behandlingsalternativ för att lindra obstruktion i HCM är kirurgiskt septal myectomy: Under detta kirurgiska ingrepp, är en variabel storlek del av övre septum bort av trans aortic tillvägagångssätt. Denna del av hypertrophied septum är därför tillgänglig för cell isolering från den friska vävnaden.

Förfarande för isolering av humant ventricular myocyter från enstaka, små transvenösa endomyokardbiopsi exemplar har tidigare utvecklat och publicerat ^19. Vi genomförde en metod för att isolera enstaka septal myocyter från ventrikulära hjärtmuskeln prover från patienter som genomgår hjärtkirurgi, inklusive patienter med HCM genomgår septal myectomy och patienter som genomgår ventilersättningsförfaranden. Förutom en detaljerad beskrivning av isoleringsprotokoll, representativ elektrofysiologiska och Ca ^{2 +} fluorescens Måtten visas, påvisa bärkraften av de isolerade humana ventrikulära myocyter och genomförbarheten av patch clamp och intracellulära ^{Ca2 +-studier.}

Protocol

De experimentella protokoll om mänsklig vävnad godkändes av den etiska kommittén för Careggi University-sjukhuset (2006 / 0.024.713, förnyade maj 2009). Varje patient gav skriftligt informerat samtycke. 1. Lösningar och utrustning Förberedelse Lösningar beskrivs i Tabell 1. Ett förenklat flödesschema för cellisolering förfarande återfinnes i fig 1. <td c…

Representative Results

Den ovan beskrivna metoden användes för att karaktärisera de funktionella abnormaliteter hos kardiomyocyter isolerade från kammarskiljeväggen av patienter med hypertrofisk kardiomyopati (HCM), som genomgick myectomy drift, jämfört med icke sönderfallande icke hypertrofiska kirurgiska patienter 21. Resultaten i detta avsnitt härrör från detta arbete 21 och visas här som ett exempel på hur denna teknik kan användas för att karakterisera förändringar i hjärtmuskelcellernas funktion i…

Discussion

Vi har beskrivit och validerat en metod för att isolera viabla myocyter från kirurgiska prover av humant ventrikulärt myokardium. Med utgångspunkt från tidigare beskrivna protokoll som framgångsrikt hade använts till isolerade celler från förmaks kirurgiska prover, tekniken för att möjliggöra separation av enskilda livskraftiga myocyter från sjuka ventrikulär hjärtmuskeln utvecklades och finjusteras. Tidiga rapporter visade att isolering av enstaka hjärtmuskelceller från bitar av förmaks-och kammarväv…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods