Summary
Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.
Abstract
Hastalıklı kalplerinden Kardiyomiyositler hücre yapısındaki değişiklikler, eksitasyon kasılma kaplin ve membran iyon akımları içeren karmaşık yeniden işlemlere tabi tutulur. Bu değişiklikler, artmış aritmojenik riski ve kalp hastalarında sistolik ve diyastolik fonksiyon bozukluğu yol açan büzülme değişikliklerden sorumlu olması muhtemeldir. Bununla birlikte, kalp hastalıklarında miyosit fonksiyonu değişiklikler üzerinde en çok bilgi hayvan modellerinde geldi.
Burada tarif ve kardiyak cerrahi operasyon geçiren hastaların ventriküler miyokardın küçük cerrahi örneklerinden canlı miyositleri izole etmek için bir protokol doğrulamak. Protokol detaylı olarak tarif edilmektedir. Elektrofizyolojik ve hücre içi kalsiyum ölçümleri, bu yöntem ile elde edilen insan ventriküler kardiyomiyositlerde tek hücre ölçümler bir dizi uygulanabilirliğini göstermek için rapor edilmiştir.
Protokol he bildirdiYeniden farklı kalp hastalıklarının mevcudiyetinde insan kalbinin fonksiyonel değişiklikler hücresel ve moleküler temelinin gelecek çalışmalar için yararlı olabilir. Bundan başka, bu yöntem, hücresel seviyede yeni terapötik hedeflerini tanımlamak için ve doğrudan translasyonel değeri, insan kardiyomiyositler yeni bileşiklerin etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.
Introduction
Miyokardın elektrofizyolojik özelliklerinin diseksiyonu tek kardiyak miyosit izolasyon tekniklerinin geliştirilmesi sonra belirgin ilerlemiştir. Kardiyak Uyarma Daralma Kavrama (EC-Kavrama) anlayışı son gelişmeler de sağlam doku tüm fizyolojik özelliklerini muhafaza uygulanabilir tek kardiyomiyositlerin izole yeteneği ile mümkün olmuştur. Yama kelepçe yöntemleri rutin kardiyak sarkolemmal iyon akımlarının fonksiyonu ve farmakolojik modülasyon çalışma istihdam edilmektedir. Ca 2 + duyarlı boyalar ile hücre içi kalsiyum dinamikleri kayıtları da düzenli EC-Kuplajın fizyolojisi yanı sıra hücre içi Ca 2 + patolojik değişiklikler ile ilgili önemli veriler sağlayan, sağlıklı ve hastalıklı modeller çeşitli tek miyositlerindeki yapılmaktadır mekanik düşüklüğü ve kalp hastalıklarında artış aritmojen yüküne yol açan homeostasis. InformaBu çalışmalardan elde edilen tion klinik ortamda ilaçların elektrofizyolojik ve mekanik etkilerini anlamak için çok önemlidir. Ancak, zar-ötesi akımları ve kardiyak ve kardiyak hareket potansiyeli mekaniği belirli özellikler için hesap, AT-Coupling proteinlerde türe özel farklılıklar vardır. Insan olmayan memelilerden izole miyosit çalışmalar biyofiziksel özellikleri ve özel zar iyon kanalları ve EM-Coupling proteinlerinin fizyolojik rolleri durulaştırmamızdan Böylece, bu durum, insan kardiyak miyosit uygun modeller sağlamaz. İnsan miyokardiyumundan canlı miyositlerin izolasyonu tam kalp hastalıklarının patofizyolojisi anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları doğrulamak için elzemdir.
Atriyal uzantıları genellikle cerrahi işlemler sırasında atılır gibi insan atriyal doku kolayca kullanılabilir. Yetişkin insan kalp aksiyon potansiyelleri ve iyonik cu ilk nicel çalışmalarrrents enzimatik olarak izole edilmiş atrial hücreler 1-4 kullanılabilir. Aksiyon potansiyelleri veya izole yetişkin insan ventriküler hücrelerinden akımların kayıtları sonradan 3,5-10 bildirilmiştir. Bu çalışmaların çoğu nakledilmiş kalplerinden edilen ve izole edilmiş hücreleri elde etmek için kolajenaz için koroner arter bölümü ya da kesilen doku nispeten büyük miktarlarda maruz kolajenaz perfüzyon ya da kullanılan hücreleri kullandık. Bu çalışmalar, sağlıklı kalpleri insan ventriküler kardiyomiyositlerinde gelen ve terminal kalp yetmezliği olan hastaların transmembran iyon akımların bir dizi ayrıntılı bir karakterizasyonu izin verdi. L-tipi Kayıtlar Ca 2 + akımı (I Ca-L), 5-7, geçici dışa potasyum akımı (I için) 8, potasyum rektifayer akım içeri doğru (I κ1) 8, geciktirilmiş düzeltici potasyum akımının farklı bileşenlerinin (I κ ) 9 bildirilmiştir. Avanslar ve rafine birizolasyon prosedürü 10, aksiyon potansiyeli uzamasını 11 içeren terminali, kalp yetmezliği, artan aritmojen potansiyelinin iyonik temeli net bir karakterizasyonu izin depolarizasyonlarından 12 sonra gecikmeli ve diyastolik depolarizasyon ve erken atım giden komik geçerli 13 arttı.
Yetişkin kardiyak miyositler, normalde çeşitli enzim karışımları ile bütün kalp, Ca 2 +-hücrelerinin toleranslı 14 arasında yüksek verimler üreten bir tekniğin retrograd perfüzyon göre küçük hayvanlardan izole edilir. Doku fragmanlarından kardiyak miyosit izolasyonu muhtemelen koroner arter perfüzyon ile elde edilene kıyasla tek miyositlerine enzimlerin sınırlı erişim doğal olarak daha az başarılı olmuştur. Çünkü kullanılmayan donör kalplerinin çok sınırlı durumu, düzenli olarak normal insan ventriküler hücreleri elde etmek tek pratik yolu enzimatik digestio tarafındanelektif cerrahi işlemler sırasında kesilip genellikle çok küçük doku parçalarının n. Iyice hücre düzeyinde karakterize edilmiştir sadece insan hastalık modeli nakledilen kalpleri erişilebilirlik nedeniyle terminali kalp yetmezliğidir. Ancak, Terminal kalp yetmezliği hastalarının bir kısmında görülür ve genellikle altta yatan neden 15 nispeten bağımsız olan miyokard hücrelerinin ciddi yeniden, ortak bir yol içerir. Hastalığın erken bir sigara başarısız aşamada hastaların tek kardiyomiyositlerin fonksiyonunu değerlendirmek için yetenek, farklı kalıtsal veya edinsel koşulların belirli patofizyolojisini anlamak için çok önemlidir. Hipertrofik kardiyomiyopati (HKM) söylüyorum örnektir. HKM, ortak bir (1/500 kişi) kardiyak hipertrofisi ile karakterize kalıtsal kardiyak durum nedeniyle çıkış yolu tıkanıklığı ve diyastolik disfonksiyon 16 aritmojen risk ve kasılma değişiklikler artar. HKM kalplerinden Kardiyomiyositler uHücre yapısındaki değişiklikler (hipertrofisi, miyofibriler kargaşa) ve EC-Kuplajını 17 içeren karmaşık bir yeniden süreçleri ndergo. Ancak, HKM'de miyositlerdeki disfonksiyon en çok bilgi transgenik hayvan modellerinde geldi. HKM hastaların sadece bir azınlık terminali kalp yetmezliği doğru geliştikçe ve kalp nakli gerektirdiğinden, HKM kalpleri standart yöntemlerle hücre izolasyonu için çok nadiren mevcuttur. Ancak, HKM hastaların en az% 30 sistolik (HKM) 18 sırasında masif septal hipertrofi değiştiren çıkış yolu kan akışı nedeniyle obstrüktif belirtiler gelişir. HKM'de tıkanıklığın giderilmesi için en etkili tedavi seçeneği mevcut cerrahi septal miyektomi: Bu cerrahi işlem sırasında, üst septum değişken ölçekli bölümü trans aort yaklaşımla kaldırılır. Hipertrofik septum bu bölümü taze dokudan izole edilmesi için, bu nedenle hücre kullanılabilir.
İnsan ventricula izolasyonu için bir yöntem,r tek, küçük transvenöz endomiyokardiyal biyopsi ile miyositler önce geliştirilen ve 19 yayımlanmıştır. Biz septal miyektomi ve kapak replasmanı işlemleri uygulanan hastalarda uygulanan HKM hastalar dahil olmak üzere kalp ameliyatı geçiren hastaların ventrikül myokard örneklerinden tek septal miyositleri izole etmek için bir yöntem uyguladı. Izolasyon protokol, temsili elektrofizyolojik ve Ca 2 + floresan ayrıntılı bir açıklama ilaveten ölçümler izole edilmiş beşeri ventriküler miyositlerde yaşayabilirliği ve yama kelepçe ve hücre içi Ca2 + çalışmalar fizibilitesini gösteren sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Insan dokusu üzerinde deneysel protokoller Careggi Üniversitesi Hastanesinde (; 2009 yenilendi Mayıs 2006/0024713) etik komitesi tarafından onaylandı. Her hasta yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.
1.. Çözümleri ve Ekipmanları Hazırlık
Çözümler, Tablo 1 'de tarif edilmiştir. Hücre izolasyon prosedürü basitleştirilmiş bir akış şeması Şekil 1' de bulunur.
| Çözüm | CP | DB | KB | TB | PS | EB1 | EB2 | |
| Reaktif (mM) | KH 2 PO 4 | 50 | ||||||
| MgSO 4 | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
| Hepes | 10 | 10 | 10 | |||||
| adenozin | 5 | |||||||
| glikoz | 140 | 10 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
| mannitol | 100 | |||||||
| boğa | 10 | 20 | 5 | 20 | 20 | |||
| NaCl | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
| KCl | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
| MgCI2 | </ Td> | 1.2 | 5 | |||||
| KH 2 PO 4 | 0.6 | 30 | 0.6 | 0.6 | ||||
| Na 2 HPO 4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | |||||
| NaHCO 3 | 12 | 12 | 12 | |||||
| KHCO 3 | 10 | 10 | 10 | |||||
| Na-piruvat | 4 | 4 | 4 | |||||
| BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
| BHBA | 5 </ Td> | |||||||
| süksinik asit | 5 | |||||||
| EGTA | 0.5 | |||||||
| K 2-ATP | 2 | |||||||
| piruvik asit | 5 | |||||||
| kreatin | 5 | |||||||
| KMES | 115 | |||||||
| Enzimler (U / ml) | Kolajenaz Tip V | 250 </ Td> | 250 | |||||
| Proteaz tipi XXIV | 4 | |||||||
| pH | 7.4 KOH | 7.3 NaOH | 7.1 KOH | 7.35 NaOH | 7.2 KOH | 7.3 NaOH | 7.3 NaOH | |
.. Tablo 1 örnek toplama, hücre izolasyonu ve miyositlerin fonksiyonel karakterizasyonu CP = kardioplejik çözümü için kullanılan solüsyonlar; DB = ayrışma tamponu; KB = Kraft-Brühe çözümü; TB = Tyrode tamponu; PS = pipet çözüm; EB1 = enzim tamponu 1; EB2 = enzim tamponu 2.
- Kardioplejik (CP) çözeltisi hazırlayın. CP çözelti kadar 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Ca 2 + ücretsiz ayrışma tamponu (DB) hazırlayın. Bu çözelti bir gün içinde kullanılmalıdır.
- Kraft-Brühe (KB) çözeltisi hazırlayın. KB çözelti kadar 1 çiş boyunca 4 ° C'de saklanabilirk.
- Ca 2 + ücretsiz Tirod tampon (TB) hazırlayın. Bu çözelti bir gün içinde kullanılmalıdır.
- Kullanmadan önce şırınga filtreleri kullanarak tüm çözümleri filtre.
- Sindirim cihazı (Şekil 2), bir elektrik motoru ile döndürüldüğünde biri silikon elastomer birbirine bakan iki fırçalar, yapılmış bir kazıma kap hazırlayın. Sindirim Cihaz özel yapılır. Sindirim aygıtında ayrıntıları Şekil 8 vardır; Cihazın görüntüleri, Şekil 2 ve 2B C içindedir. % 70 etanol ve su ile doku odası yıkayın.
Miyokard Örneklerinin 2.. Toplama ve İşleme
- 50 ml'lik bir tüp içinde cardiplegic (CP) çözeltisi 40 ml dökün ve hücre izolasyon laboratuara ameliyat oda numune taşıma için buz içinde depolar.
- Buz ile yıkayın, hemen çıkarıldıktan sonra ameliyat odasından ventriküler miyokard örnek toplamakCP çözeltisi ve bu tüp içinde saklayın. Açık kalp ameliyatı sırasında üst arası ventriküler septum, ağırlık> 100 mg kesilip endokardiyal örnekleri kullanın.
- Hızla laboratuar alanına numune aktarmak; Numune eksizyondan 10 dakika içinde numune işleme başlar.
- Buz gibi soğuk CP tamponu örnek tutarken, dikkatli bir stereo mikroskop altında ince bir makas kullanarak endokardiyal fibrotik tabakayı kaldırmak; sonra, küçük parçalara (uzun 2-3 mm) miyokard doku kesti. Doku numunesi büyüklüğüne bağlı olarak, her bir izolasyon için 100 mg ila 1 g arasında ventriküler miyokardın toplam miktarı kesti.
- Doku kıyma haline gelme işleminin tamamlanması üzerine, buz gibi soğuk temiz CP çözeltisi ile, sindirim cihazı içine miyokard parçalar aktarın. Artık toplam doku g 1'den kullanarak, miyokard parçaları ile iki silikon fırça arasındaki tüm hacmi (3-4 ml) doldurmaktan kaçının.
3.. Yıkama ve Miyokard topakları Sindirim
- Kıçtaparçalar sindirim cihazın kazıma odasına transfer edilir, er, soğuk Ca2 + içermeyen ayrışma tamponu (DB) ile oda içindeki CP tampon değiştirin.
- Banyosu içinde ısıtılmış, su (Şekil 1) ile temas halinde olması için bölme için sırayla, termostatik banyoda sindirim yerleştiriniz. 37.5 ° C banyo ayarlayın ve yavaş yavaş doku odasının sıcaklığını yükseltmek için, açın. 1 devir / saniye dönme hızını ayarlayarak, sindirim cihazının motora çevirin.
- Her 8 dakika temiz DB ile oda içindeki solüsyonu değişen, DB ile 3 yıkama çevrimi gerçekleştirin. DB (37 ° C) ısıtılır ve oksijen miyokard parçalar ile temas etmeden önce doymuş.
- DB çözeltisine kollajenaz Tip V ve 4 U / ml Proteaz tipi XXIV 250 U / ml eklenerek enzim tamponu 1 (EB1) hazırlayın. DB çözüm 250 U / ml kollajenaz Tip V ekleyerek enzim tamponu 2 (EB2) hazırlayın. (37 ° C) ve oxygenat ısınmake EB1 ve EB2.
- (37 ° C)% 100 oksijenli EB1 ile dönen sindirim cihazda sindirim iki 12 dakika döngüleri yapın. Her bir döngüde, bir EB1 ~ 3 ml kullanın. Pipet aspirasyonu ile çözüm çıkarın ve her döngüden sonra atın.
- Hücresi ile toplama ve ~ tamponlar elüsyon için soğuk (4 ° C) KB çözeltisi 80 ml için 6 15 ml tüpler hazırlayın.
- 37 ° C de 3 ml% 100 oksijene EB2 ile bir birinci 15 dakika sindirim çevrimi gerçekleştirme Sindirim devresini sonra, 15 ml bir tüp içinde birinci ayrışmış miyositleri içeren çözelti toplamak ve 12 ml soğuk KB çözeltisi ile hücre süspansiyonu seyreltin. Oda sıcaklığında tüp düz saklayın.
- Aşağıdaki sindirim devir için V kolajenaz konsantrasyonunun yarıya amacıyla DB eşit bir miktarı ile geri kalan EB2 çözeltisi ile seyreltilir.
- 37 ° C de 3 ml EB2 diğer 5 12 dakika sindirim döngüleri yapın; bunların her biri ardından 15 ml konik bir tüp içinde tampon içeren miyosit ve toplamak ve12 ml KB çözeltisi ile seyreltilir. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, 6 hücre ihtiva eden tüpler saklayın.
4. Hücre tabanda ve Ca 2 + READAPTAYON
- 20 ml Ca 2 + içermeyen Tyrode tamponu (TB) ve 1 mg / ml sığır serum albümini (BSA) ilave edin. Çözüm Filtre.
- Yerleşmek için miyositleri zorlamak için 5 dakika boyunca 100 x g'de altı miyosit içeren konik santrifüj tüpleri. Süpernatantı ve oda sıcaklığında TB içeren BSA (verim bağlı olarak 1-3 mi) değişken bir miktarı ile, her bir tüp içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Yavaş yavaş 100 mmol / L CaCI2 çözeltisi, az miktar eklenerek hücre ihtiva eden tampon içinde Ca2 + konsantrasyonu artar. Birinci ve ikinci adım olarak Ca2 + konsantrasyonu sırasıyla 50 umol / L ve 100 umol / L 'ye kadar yükseltilir. Aşağıdaki Ca 2 + ekleme adımlarını her 5 dakikada gerçekleştirilir ve konsantrasyon her adım t 100 umol / L ile yükseltilir0.9 mmol / L OA nihai konsantrasyonu
- Izolasyon prosedürü verimini değerlendirmek. Mikroskop cam alt bölmesi üzerine miyosit ihtiva eden bir çözeltinin 0.5 ml aktarın. 10x objektif büyütmede 15 mikroskop alanları değerlendirmek ve (net izlerse ve anlamlı içerikleri ile, örneğin çubuk biçimli hücreler, Şekil 2) sağlıklı miyositlerin yüzdesini hesaplamak. Beklenen verim% 20 civarındadır.
İzole kardiyomiyositlerinin 5. Fonksiyonel Değerlendirme.
Aşağıdaki protokol hareket potansiyellerine ve hücre içi Ca2 + akıları eş zamanlı kayıt dahil olmak üzere insan kardiyomiyosit fonksiyonel değerlendirmesi örneğidir.
- Delikli yama yapılandırmada yama kelepçe deneyler için pipet çözüm (PS) hazırlayın. Çözelti, 3 aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Ca 2 + ücretsiz Tirod tampon (TB) 1.8 mmol / L CaCl 2 ekleyin. Use patch clamp / floresan deneyleri sırasında kardiyomiyositlerin süperfüzyon için bu çözüm.
- 1.5 ml tüp aktarın hücre süspansiyonu 1 ml ve 10 umol / L ve 10 ul Fluoforte Powerload Konsantre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, dikey konumda boru seti ve 5 dakika için yerine getirilmesi için hücreyi terk; Ca hücreleri tekrar süspansiyon 2 + TB içeren.
- (: 37 ± 0.5 ° C sıcaklık), küçük bir (0.5 mi) hücre süspansiyonu, 0.25 ml transfer, sıcaklık kontrollü mikroskop 0.3 ml / dk 'lık bir akış hızında ısıtılmış microperfusor sistemi ile yer çekimi ile süperfüze kayıt odası, monte edilebilir.
- Mikropipet çektirmenin kullanarak, 3-5 um'lik bir uç çapı ve PS ile dolu 3 M 4.5 arasında bir direnç ile yama kelepçe pipetler hazırlar.
- PS (250 ug / ml) içinde bir toplu amfoterisin B ekleyin ve elektrotlar doldurmak için kullanın.
- Kapanım yoksun açık desenli bir çubuk şeklinde hücreyi, fo seçinerişim direnci altında 20 MQ düşene kadar rm, 5 ile 10 dakika giga mühür ve bekleyin.
- Stimülasyon farklı frekanslarda (0.2 Hz, 0.5 Hz, 1 Hz, her bir frekansta 1 dakika) kısa darbeleri (<3 msn) kullanılarak geçerli kelepçe modunda aksiyon potansiyelleri toplayın. Kayıt aşamasında, 492 ± 3 nm parlak alan aydınlatma açmak ve 505-520 nm Fluoforte floresan algılar. Floresan Edinme ve Digidata 1440A ve pClamp 10.0 yazılımını kullanarak potansiyel sinyalleri membran. Gerekirse kayıt dizisini birden çok kez tekrarlayın; Ancak, her hücre için 15 dakika aşağıda toplam kayıt süresini tutmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Olmayan başarısız olmayan hipertrofik cerrahi hastalarında 21 ile karşılaştırıldığında, yukarıda açıklanan yöntem, miyektomi operasyon yapıldı hipertrofik kardiyomiyopati (HKM) hastalarda interventriküler septum izole kardiyomiyositlerin fonksiyonel anormalliklerini karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu bölümde yer alan sonuçlar, çalışma 21 elde edilir ve bu teknik kardiyak hastalık koşullarında miyokard hücresi işlevinin değişiklikler karakterize etmek için nasıl kullanılabileceğini bir örnek olarak burada gösterilmiştir.
HCM bir hastadan cerrahi bir numune için temsili Şekil 2A'da gösterilmiştir. Cerrahi numuneler bir boyut ve endokardiyal lifli çizgiler kalınlık açısından son derece değişken olmuştur. Biz HCM örneklerden her izolasyon prosedürü için kullanılan miyokardiyal doku miktarı 1 g civarındaydı. Bunun yerine, kontrol numuneleri için kullanılan doku miktarı (100-500 mg.) Daha küçük, Lowe nedeniyler doku kullanılabilirlik. Doku içinde canlı miyokard hücrelerinin nispi miktarı HCM miyokardiyumda azalır ve Endomiyokardiyal fibroz 22 artar muhtemelen verimi, kontrol numuneleri HCM göre işlenmiştir önemli ölçüde daha yüksek olmuştur. Bu gözlemden hayatta kalabilen hücreler elde etmek için doku gerekli miktarda miyokardiyal hastalığın varlığı veya yokluğu ile ilgili olarak değişken olabileceği sonucuna varılmıştır.
Şekil 2B'de gösterildiği gibi, Örnekler küçük parçalar halinde kesilmiştir. Daha sonra, parçalar sindirim cihazı (Şekil 2C) odacık içine aktarılır (Şekil 2D), yukarıda tarif edildiği gibi tek bir hücre izolasyonu için kullanılmıştır. Bir septum numuneden tarif edilen hücre izolasyon prosedürü kullanılarak elde edilen bir hücre süspansiyonu Örnek fotomikrografı Şekiller 3A ve 3B 'de gösterilmiştir; Tek ventriküler ca büyütülmüş görüntülerirdiomyocytes Şekiller 3C-3F'de gösterilmektedir. HCM örneklerden Kardiyomiyositler aksiyon potansiyeli ve protokol bölümünde tarif edildiği gibi, hücre içi Ca2 + varyasyon eşzamanlı kayıtları için kullanılmıştır. 3 farklı frekanslarda uyarılması sırasında zar gerilimi (yukarıda) ve hücre içi Ca 2 + (aşağıda) gösterilen Örnek eşzamanlı izleri, Şekil 4 'de gösterilmiştir: Bu izler, bir HCM numuneden izole tek kardiyomiyosit kaydedildi.
Yama kelepçe çalışmalarının sonuçları uyarımı çeşitli frekanslarda kaydedilen aksiyon potansiyeli süresi (APD) belirgin şekilde kontrol grubu (Şekil 5A ve 5B) ile karşılaştırıldığında HCM (HCM kardiyomiyositlerde) olan hastalardan alınan kardiyomiyositlerde uzun olduğunu gösterdi. Β-adrenerjik 7 M (Şekil 5C) - izole miyositlerde fizyolojik tepkilerin bakım belirlemek için, 10 ° el, izoproterenol etkilerini test ettikGIC uyarım kontrol miyositlerde beklenen AP kısalma üretti. Uzun süreli APD erken depolarize edici (EADS) 23 sonrası riskini artırdığına yana, EADS oluşumu, AP plato aşamasında spontan depolarize edici ard tespit ölçüldü. HKM kardiyomiyositlerinde, EADS kontroller (Şekil 5D) göre anlamlı olarak daha sıktı. Birden EADS gösteren Temsilcisi iz Şekil 5E'de gösterilmiştir
Uzun APD ve iyon akımı anormallikleri HKM kardiomyositlerindeki uyarılma-kasılma birleştirme mekanizmaları etkileyebilir olmadığını test etmek için, hücre içi Ca 2 + varyasyonlarının özelliklerini uyarılma sırasında değerlendirildi. 2 + geçici akım kelepçe koşullarda uyarılmış Ca genliği kardiyomiyositlerin (Şekil 6A) kontrol karşılaştırıldığında HCM'de benzerdi. Tersine, Ca 2 + transient kinetiği, (Şekil hcm belirgin olarak daha uzundur6B). Buna ek olarak, hücre içi Ca2 + diyastolik konsantrasyonu kardiyomiyositlerde (Şekil 6C) kontrol ile karşılaştırıldığında hcm belirgin olarak daha yüksek olduğu ve uyarım frekansında artması ile daha belirgin bir artış göstermiştir.
Özellikle, insan ventriküler örnekleri bu yöntem ile izole edilen kardiyomiyositlerde da başarılı bir şekilde hücre içi Ca + ve / veya hücre elektriksel alan stimülasyonu sırasında kayıt kısalma (Şekil spesifik zar akımlar (Şekil 7A) ve voltaj-kelepçe kayıtları da dahil olmak üzere, diğer uygulamalar için, 2 kullanılmıştır 7B) ve konfokal mikroskopi ve zara bağlı floresan etiketler (Şekil 7C) kullanılarak sarcolemma ince yapısı değerlendirilmesi.
Hücre izolasyon prosedürü 1.. Akış Şekil.
Septal miyektomi operasyon yapıldı HCM ile bir hastanın ventriküler miyokardın bir örneğini gösteren hücre izolasyonu için ventriküler örneklerinin Şekil 2.. İşleme. (A) Temsilcisi görüntü. Bir ventriküler cerrahi örnekten ventriküler doku kesme Kalibrasyon bar = 5mm. (B) topakları, hücre izolasyonu için kullanılacak. Kalibrasyon bar = sindirim cihazının 5mm. (C) Görüntüler. Cihaz iki silikon fırçalar ile sindirim odası ihtiva eder: üst fırça, bir motor ile hareket döndürmek mümkün ventriküler dokunun enzimatik sindirimi sırasında termostatlı banyosu içindeki sindirim cihazını gösteren (D) Görüntü.. p>
Şekil 3.. İzole insan ventriküler kardiyomiyositler. (AB) paneli temsilcisi kardiyomyosit süspansiyonları gösteren iki mikroskop alanlar (10x objektif) fotomikrografları gösterir. Not, hücrelerin yaklaşık% 30 çubuk şekilli ve açık yarıkları göstermektedir. Kalibrasyon bar = 100 mikron. (CE), bir HKM hastada (40x objektif) bir örnekten izole 3 insan kardiyomiyositlerin Temsilcisi görüntüler. Kalibrasyon bar = kayıtları için yama pipet ucu ile dokundu insan ventriküler kardiyomiyositlerin gösteren 20 um. (F) Görüntü. Kalibrasyon bar = 20 um.
es.jpg "src =" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
Membran potansiyeli (yukarıda) ve hücre içi kalsiyum gösteren Şekil 4,. Membran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum eşzamanlı kaydı. Örnek trace (aşağıda verilmiştir) bir HCM numuneden izole edilmiş bir tek miyosit kaydedildi. Miyosit yama 0.2 Hz pipet, 0.5 Hz, 1 Hz ile uyarılır.
Şekil 5. HKM örneklerinden ventriküler kardiomyositlerindeki aksiyon potansiyelleri değişiklikler. (A) Temsilcisi sağ, siyah izleri (0.2 Hz, 0.5 Hz ve bir kontrol (sol, gri iz) miyositinin ve HKM miyositinin 1 Hz ortaya aksiyon potansiyelleri bindirilmiş ). (B) Ortalama aksiyon potansiyeli HKM'de% 90 repolarizasyonun (APD90%) de süresi (n = 81) veHKM hastalar ve kontrol örneklerinde kardiomyositlerindeki EADS kontrolü kardiyomiyositler (n = 29) test üç uyarım frekanslarda. (C) oluşumu. (D) yokluğunda (sürekli iz) bir kontrol miyositinin gelen 0,5 Hz'de aksiyon potansiyelleri süperempoze 10 -7 M izoproterenol mevcudiyetinde. (E) oklarla işaretlenmiştir (erken depolarizasyonlarından EADS sonra) plato fazı sırasında ortaya çıkan çok sayıda kendiliğinden kutupsallık giderilişlerini görüntüleyen bir HCM hastadan bir kardiyomiyosit zar potansiyeli gösteren Örnek izi. Uyaranlar iz altında kısa çizgilerle işaretlenir. ** = P <0.01 t-test. Şekilde tüm paneller Coppini ark izni ile değiştirilmiştir. 2012 21..
Rakam6.. HKM örneklerinden ventriküler kardiyomiyositlerin kalsiyum Transientlerin değişiklikler. (A) Temsilcisi kalsiyum geçişleri kontrol miyositinin içinde yama pipet (gri) ve HKM hücre (siyah) üzerinden 0.2 Hz stimülasyon sırasında ortaya bindirilmiş. Özellikle, Ca 2 + Transientlerin genliği iki hücre arasında bir fark yoktur (B) HKM'de Ca 2 + Transientlerin kinetiği (n = 42) ve kontrol (n = 24) kardiyomiyositler:. Zaman uyaran geçici (TP zirve ),% 50 çürüme (T50%) ve geçici% 90 bozunma (T90%) için tepe zaman zirvesine kadar geçen süre gösterilmiştir. (C) hücre içi Ca arası Örnek uzun izleri hcm 3 farklı frekanslarda uyarılması sırasında 2 + ve HCM miyositinin yüksek atım hızlarında artış diyastolik Ca 2 + vurgulayarak kontrol miyositler. (D) 3 farklı uyarım ra de ortalama diyastolik Ca 2 HKM'de + (n = 42) ve kontrol (n = 24) kardiyomiyositlertes. ** = P <0.01 eşleşmemiş t testi. Şekilde tüm paneller Coppini ark izni ile değiştirilmiştir. 2012 21..
.., Insan ventriküler miyositleri kullanarak Şekil 7 ek deneysel uygulamaları (A) Sol: temsilcisi L-tipi Ca gösteren izleri üst üste 2 + akım (ayrıntılar için bkz: 21), belirli bir protokol ile farklı membran gerilimlerde gerilim kelepçe altında kaydedilmiştir. Sağ: Farklı membran HKM örneklerden izole edilen 18 hücrelerinden ortalama L-tipi Ca 2 + tepe akım yoğunluğu. Gerilimler. (B) Hücre içi Ca 2 + iz 1 Hz elektriksel alan stimülasyonu sırasında ventriküler miyositinin kaydedilmiş. Ventriküler kardiyomiyopati (C) Eşodaklı görüntüBir zar bağlı floresan boya (Di-3-ANEPPDHQ) ile boyanmış bir HCM örnekten yocyte. Not, ttubules yoğunluğu HKM'de morfolojik membran yeniden düşündüren, düşüktür.
Şekil 8. Sindirim aygıtı. Sindirim cihazının (AB) Bileşenleri. Bir değişken hızda dönen motorun ikinci bir birine bağlı olan bir birinci plastik koluna bağlanır. Ikinci plastik kolu kaldırılabilir ve üst fırça bağlanır. Fırçalar silikon elastomer ile yapılır. ~ 1.5 mm aralıklı 100 delikli bir PTFE negatif kalıp, sıvı silikon fırça atmak için kullanıldı. Kalıbın iç alan 1.9 cm bir çapa sahiptir ve aynı büyüklükte fırçalar üreten ve kalınlığı 6 mm. ' Kalıbın bir tarafında yer alan delikler 8 mm uzunluğunda kıllar üretmek amacıyla söz konusu olduğunda bu fırçalarkalıp döküm ve kaldırılır. Sıvı silikon kalıba konur sonra en az 48 saat tam sertleşme için ihtiyaç vardır. Fırçalar bir cam tüp içine monte edilmiştir (iç çapı = 2 cm, kalınlığı 2 mm) ve iki fırçalar ve cam duvarlar ile oluşturulan silindirik bir odacık hava geçirmez bir şekilde iki lastik O-ring ile sızdırmaz kılınmıştır. Fırçalar diğer bir itilmesi gerekir; alt, bir üst, bir motor kolun ucuna plastik yapıştırılmış iken, plastik bir taban üzerine yapıştırılmış ve böylece döndürmek mümkün olur. (C) üst fırçanın incelemeler Büyütülmüş. Not, fırça o (D) bölmenin bileşenlerinin nihai konumunda gösterilmektedir döndürmek için sırayla motor kolunun ucunda yapıştırılmış olması gerekmektedir. İki fırça (fiili odası) arasındaki boşluk ~ 2 cm genişliğinde ve yüksek 7-8 mm; bu boşluk kolaylıkla miyokardiyal doku içindeki 1 g kadar başka bir tampon 3-4 ml, uyar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu tarif edilen ve insan ventriküler miyokardın cerrahi örneklerden uygun miyositleri izole etmek için bir yöntem onaylamıştır. Başarılı bir şekilde hastalıklı ventriküler miyokardın ikinci bir uygun miyosit ayrılması geliştirilmiş ve ince ayarlı edildi izin vermek için atrial cerrahi örnekler, bu teknikle izole edilmiş hücrelere kullanılmıştır, daha önce tarif edilen protokollere başlayarak. Erken raporlar seçici, fizyolojik uyaran 8,24 ile değiştirilmiş elektrofizyolojik özellikleri ve yanıtları ile sonuçlanır, potasyum akımları repolarize bozulmuş atriyal ve ventriküler doku parçaları ikinci bir kardiyomiyositlerin izolasyon koroner perfüzyon yoluyla tampon içeren enzim dağıtım geciktirilmiş doğrultucu zarar yoktu, oysa gösterdi izole hücreler 25 akımları. Ne yazık ki, ventriküler miyokardın cerrahi örneklerden insan ventriküler miyositlerinde izolasyonu koroner dallarının bütünlüğü bu yana koroner perfüzyon ile gerçekleştirilemezeksplante kalpleri uymayacak, kaybolur. Bizim yöntemi kullanılarak miyokardiyal parçalar izole kardiyomiyositlerde uyarım frekansının değişikliklere yanıt olarak hareket potansiyeli süresinin açık bir şekilde uyum göstermek veya adrenerjik stimülasyon β için. Meydana gelen bu tür tepkiler için için, geciktirilmiş düzeltici potasyum kanallarının bütünlüğü izolasyon yöntemi ile bozulmuş değildir, bu kanallar genel bütünlüğünü düşündüren, 26-28 gereklidir. Ayrıca, bizim yöntemlerle izole edilmiş hücreler normal elektrofizyolojik tepkileri (Şekiller 3 ve 4) göstermektedir, ancak, aynı zamanda, kalsiyum beklenen şekil ve süreye sahip geçişlerini (Şekiller 3 ve 5) ve normal sarkomerik organizasyonu (Şekil 2) ve kısalma özellikleri (değil, sadece görüntüleme ) gösterilmiştir, bu hücrelerin genel yapısal bütünlüğü, bu izolasyon prosedürü ile, korunmuş olduğunu düşündürmektedir. Önceki üzerinden bu yöntemin temel ilerlemesiteknikler fazla zarar vermeden tek bir hücre ayırma sağlayan, doku parçaları yumuşak mekanik karıştırılmasını sağlayan yeni tasarlanmış sindirim cihazı ile sağlanmaktadır. Ayrıca, sindirim cihazın kullanımı sayesinde hücre izolasyon tamponunda enzim daha düşük bir konsantrasyonda kullanabilirler; Özellikle daha önce bildirilen yöntemlere 24 ile karşılaştırıldığında, selektif olmayan proteazın çok daha düşük bir konsantrasyonda kullanılmaktadır. Aygıt, laboratuvarda yapılmıştır: Yapı, Şekil 8'de şematik olarak gösterilmiştir.
Basit tasarımı ve yapısı bu protokolün başarılı bir sonuç için çoğaltmak çok kolay hale getirir. Şekil 8'e efsane de silikon fırçaları üreten ve kazıma odasını oluşturmak için gerekli prosedürleri anlatır. Sindirim cihazın avantajları, yaşayabilir hücrelerin nispeten yüksek sayıda (100 mg kadar), ventriküler dokunun nispeten düşük bir miktarda elde edilebilir.Daha önceden yayınlanmış bir yöntem 19 küçük bir biyopsi (hatta <20 mg), bir kalsiyum dayanıklı miyositleri sağlamak gösterilmiştir. Ancak, bildirilen miyositlerdeki verim çok düşük olduğunu ve yazarlar bu yöntemle izole edilmiş hücreler, hücre içi kalsiyum bisiklet ve kasılma fonksiyonu karakterizasyonu için uygun olup olmadığı gelmedi. Interventriküler septum küçük porsiyonlarda sık sık kapak replasmanı prosedürleri (örneğin. Aort kapak replasmanı) sırasında eksize çünkü bu teknik, birçok cerrahi hastalarında potansiyel uygulanabilir. Ancak, başarılı bir izolasyon elde etmek için önemli nokta işletim odadan örnek alınmasından sonra prosedürün hızlı bir başlangıç olduğunu. Bu nedenle, verimli olması için, bu teknik için sırayla, kalp cerrahisi klinik yakın olmak üzere hücre laboratuar için gereklidir. Buna ek olarak, uygun bir enzim aktivitesi, başarılı bir izolasyonu için de son derece önemlidir. Yana selektif olmayan proteaz aktivitesi of Her kollajenaz toplu genellikle tamamen test değil, her yeri hücre izolasyonu sırasında farklı gerçekleştirmek olasıdır. Bu nedenle en iyi sonucu elde etmek için ince ayar kolajenaz nihai konsantrasyon için gereklidir. Bu canlı hücre döngüsü 3 görünen başlangıç emin olmak için, her bir döngüde mikroskop altında hücre süspansiyonu gözlem önermek hücrelerinin erken görünümü fazla enzim aktivitesi göstermektedir ve enzim konsantrasyonunun azaltılmasına yönelik ister.; 3 döngü sonra hücrelerin görünümü yetersiz enzim aktivitesini göstermektedir. Deneyimlerimize göre, bu doğru enzim konsantrasyonunun en etkili göstergesidir.
Biz başarıyla sol ventrikül çıkış yolu darlığı cerrahi septal miyektomi geçiren, yanı sıra sivil-başarısız olmayan hipertrofik cerrahi hastalarında 21 ile HKM hastalarının inter-ventriküler septum tek kardiyomiyositlerin elde etmek için bu yöntemi kullandık. O kağıttan Sonuçlarıeş zamanlı olarak florasan boya ile hücre içi kalsiyum dinamiklerinin kaydederek, EC-kaplin anormallikleri değerlendirilirken bu yöntem ile izole edilen myocytes patch clamp teknikleriyle tam elektrofizyolojik değerlendirme için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Burada açıklanan kayıt prosedürü bize böylece hücreler ve numune sınırlı sayıda veri büyük miktarda üretilmesi, her bir hücre tek kayıt ile çeşitli fizyolojik bir hücre parametreleri toplamak bırakıldı. Non hipertrofik hastalarda 21 ile karşılaştırıldığında, bu avantajları sayesinde, bu yöntem başarılı bir şekilde, HCM hastaların ventriküler kardiyomiyositlerde belirli işlevsel anomalileri karakterize etmek için kullanılmaktadır. Iyon akımı ve hareket potansiyeli süresi, hem de kinetik anomalilerin anormallikleri od hücre içi Ca2 + bisiklet açık bir şekilde yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile, bu teknik kullanılarak tespit edilmiştir. Buna ek olarak, geç Na + için seçici bir inhibitörü ile tedavinin göstermiştir vs ranolazin ile bir çift kör klinik denemenin gelişmesine yol açmıştır. halen devam etmektedir HCM 29, hastalarda plasebo.
İnsan kardiyak örnek durumuna hatta özel merkezlerde, nispeten mütevazı, ve bu tekniğin geniş uygulanabilirliği kısıtlayabilir. Bununla birlikte, doğrudan kardiyomiyosit fonksiyonunda hastalık ile ilgili değişiklikleri hasta örneklerinden elde edilebilir bilgilerin kalitesi HCM ve diğer kalp hastalıklarının hayvan modellerinde elde edilebilenden karşılaştırılabilir. Arasındaki farklar göz önüne alındığında, genişİnsan ve murin kardiyak miyositler fizyolojisi, insan miyosit fonksiyonel değerlendirme veriler son derece değerli olabilir. Sonuç olarak, bizim protokol derhal öteleme değeri ile, hasta numunelerinin doğrudan hücreler üzerinde fonksiyonel değerlendirmelerin tam bir set yapmak için imkanı sağlar beri bu tekniğin gelecekte uygulamaları önemli ölçüde, kalp hastalıkları bilgisine katkıda inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, AB (STREP Proje 241577 "BÜYÜK KALP," 7. Avrupa Çerçeve Programı, CP), Menarini Uluslararası Operasyonlar Lüksemburg (AM), Telethon GGP07133 (CP) ve Gilead Sciences (AM) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |
References
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
- Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
- Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
- Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
- Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
- Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
- Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
- Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
- Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
- Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
- Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
- Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
- Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
- Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
- Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
- Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
- Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
- Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).
