Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Ein auf lebenden Zellen basierendes Verfahren zur Beleuchtung von zellulären Vakuolen (Einschlüssen), die Chlamydien enthalten, wird beschrieben. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle, automatisierte Bestimmung der Infektiosität von Chlamydien in Proben und kann zur quantitativen Untersuchung der Wachstumsdynamik des Einschlusses verwendet werden.

Zusammenfassung

Das obligate intrazelluläre Bakterium Chlamydia stellt eine große Belastung für die globale öffentliche Gesundheit dar. C. trachomatis ist die häufigste bakterielle Ursache für sexuell übertragbare Infektionen und auch die Hauptursache für vermeidbare Blindheit in der Welt. Eine wesentliche Determinante für eine erfolgreiche Infektion von Wirtszellen durch Chlamydien ist die Fähigkeit des Bakteriums, die Signalübertragung der Wirtszelle aus einem neuartigen, vakuolären Kompartiment, dem sogenannten Einschluss, zu manipulieren. Aus dem Einschluss erhalten Chlamydien die Nährstoffe, die für ihr 2-3-tägiges Entwicklungswachstum erforderlich sind, und sie sezernieren zusätzlich eine Reihe von Effektorproteinen auf die zytosolische Fläche der Vakuolenmembran und in das Zytosol des Wirts. Lücken in unserem Verständnis der Biologie der Chlamydien stellen jedoch erhebliche Herausforderungen für die Visualisierung und Analyse dieses intrazellulären Kompartiments dar. Kürzlich wurde eine Reverse-Imaging-Strategie zur Visualisierung des Einschlusses mit Hilfe von GFP-exprimierenden Wirtszellen beschrieben. Dieser Ansatz nutzt die intrinsische Undurchlässigkeit der Einschlussmembran für große Moleküle wie GFP rational aus. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie GFP- oder mCherry-exprimierende Wirtszellen für die anschließende Visualisierung von Chlamydieneinschlüssen erzeugt werden. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass diese Methode kostspielige Antikörper-basierte Enumerationsmethoden effektiv ersetzt, zusammen mit anderen fluoreszierenden Markierungen, wie z. B. GFP-exprimierenden Chlamydien, verwendet werden kann und zur Ableitung wichtiger quantitativer Daten über das Wachstum der Einschlussmembran aus einer Reihe von Chlamydien-Spezies und -Stämmen genutzt werden kann.

Einleitung

Infektionskrankheiten durch Arten der intrazelluläre Bakterium Chlamydia verursacht entlocken eine große Belastung für die globale Gesundheit, einschließlich sexuell übertragbare Krankheit, entzündliche Erkrankungen des Beckens, Blindheit, Pneumonie und möglicherweise Atherosklerose ^1-4. Die Fähigkeit von Chlamydia um mit der Wirtszelle wechselwirken, innerhalb einer Vakuole (genannt die Aufnahme), ist ein kritischer Faktor für die erfolgreiche Infektion von Zellen und dem Host. Die Aufnahme ist eine neuartige pathogenen Fach, die Chlamydien-Wachstum ermöglicht und wird dynamisch über die gesamte 2-3 Tag Entwicklungszyklus von Ch....

Protokoll

1. Erzeugung von Leuchtstoff-Wirtszelllinien

1. Tag 1. Platte 293T-Zellen (oder andere retrovirale Verpackungslinie) auf 6-Well-Platten mit ² × 10 6 Zellen / Vertiefung, zu sein ~ 75% konfluent am nächsten Tag. Falls gewünscht, um die Platte zwei Vertiefungen für jede Retrovirus verwendet werden.
2. Tag 2. Saugen Sie Zellen und 2 ml frisches Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin). Transfektion von Zellen mit 5-8 & mgr; g jedes der retroviralen Vektor (enthaltend GFP) und Verpackungsvektor (z. B. pVSVg) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 oder einem ähnlichen Reagenz, und nach den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Säugetierzellen, die cytosolische fluoreszierende Proteine ​​(zB GFP) kann konstruiert werden, um die Beleuchtung des Chlamydiaeinschlüssen einem lebenden, infizierten Zellkulturen zu ermöglichen. Nach Infektion mit Chlamydia, sind Einschlüsse leicht als schwarze Flecken in den Wirtszellen (Abbildung 1) sichtbar. Die Klarheit der fluoreszenz fehlt Einschlüsse für die automatisierte Identifikation der Einschlüsse in zahlreichen Bereichen und / oder den Behandlungen (Fig.......

Diskussion

Hier beschreiben wir die experimentelle Strategie zur Erzeugung von Fluoreszenz-Wirtszellen für die Echtzeit-Visualisierung und Analyse von Chlamydia Einschlüsse. Diese Vakuole Visualisierung Ansatz eröffnet die leistungsfähige Möglichkeit, im Laufe der Zeit zu beleuchten, zu verfolgen und quantitativen Messung der dynamischen Eigenschaften von Chlamydieneinschlüsse in Populationen von Zellen oder in Einzelzellen. Chlamydia Einschlüsse in fluoreszierendem Protein markierte Zellen sind auffallend gut de.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0,45 &Mikro; m filter	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 ohne phenolrot	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximid	Sigma	C7698
Glasbodenschalen	MatTek	P35G-1.5-14-C
Objektkammern, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534