Den hurtigste Western i byen: et moderne twist på den klassiske Western Blot-analyse

Summary

Denne protokol udforsker de seneste fremskridt i udførelsen af ​​Western blot-analyser. Disse nye ændringer ansætte en bis-tris gel-system med en 35 min elektroforese køre tid, en 7 min tør blotting transfer-system, og infrarødt fluorescerende protein detektion og billeddannelse, der genererer højere opløsning, kvalitet, følsomhed og forbedret nøjagtighed vestlige data.

Abstract

Western Blot-teknikker, der oprindeligt blev etableret i slutningen af ​​1970'erne, er stadig aktivt udnyttes i dag. Men denne traditionelle metode med Western blotting har flere ulemper, der omfatter lav kvalitet opløsning, falske bands, nedsat følsomhed, og dårlig protein integritet. Nylige fremskridt har drastisk forbedret mange aspekter af standard Western blot-protokollen til at producere højere kvalitative og kvantitative data. Bis-tris gel-system, et alternativ til den konventionelle Laemmli systemet genererer bedre protein separation og opløsning, vedligeholder protein integritet og reducerer elektroforese til en 35 min køretid. Desuden iBlot tør blotting-systemet, forbedrer dramatisk effekt og hastighed af protein overførsel til membranen i 7 min, hvilket er i modsætning til de traditionelle protein overførselsmetoder, som ofte er ineffektive med lange overførselstider. I kombination med disse meget innovative ændringer, protein detection bruge infrarød fluorescerende billeddannelse resulterer i højere kvalitet, mere præcis og sammenhængende data i forhold til standard Western blotting teknik kemiluminiscens. Denne teknologi kan samtidigt detektere to forskellige antigener på den samme membran ved anvendelse af to-farve nær-infrarøde farvestoffer, der er visualiseret i forskellige fluorescerende kanaler. Desuden linearitet og brede dynamikområde fluorescerende billedbehandling giver mulighed for præcis kvantificering af både stærke og svage protein bands. Således er denne protokol beskriver de vigtigste forbedringer af den klassiske Western blotting metode, hvor disse fremskridt øge kvaliteten af ​​de data, mens høj grad reducerer ydeevnen tid for dette eksperiment.

Introduction

Teknikken med Western blotting blev først udviklet mellem 1977 og 1979 for at skabe en bedre metode til påvisning af proteiner under anvendelse af antistoffer ^1-3. Denne procedure anvendes elektroforetisk overførsel af proteiner til membraner fra SDS-PAGE-geler med målproteiner visualiseret ved hjælp af sekundære antistoffer, og påvist ved autoradiografi, UV-lys eller en peroxidasereaktion produkt ^3. Således er disse samme grundlæggende principper stadig meget udbredt i dagens Western blot protokoller. Men denne klassiske Western blotting teknik frembyder mange ulemper, såsom langsomme elektroforese køre tider, lav opløsning og kunstige protein bands, følsomhed over for protein nedbrydning og begrænset følsomhed samt dårlig datakvalitet ^4. Derfor er denne protokol beskriver betydelige fremskridt og forbedringer til den standard Western blot procedure, der genererer mere præcise kvalitative og kvantitative data.

"> Det Laemmli-system til adskillelse af en bred vifte af proteiner ved brug af SDS-PAGE er den mest udbredte gel system til Western blotting ^5. Trods af populariteten af denne Western blotting-system, kan denne metode resultere i band forvrængning, tab af opløsning, og falske bånd ^4. Dette kan være en konsekvens af deaminering og alkylering af proteiner på grund af den høje pH-værdi (9,5) i separationsgel, reoxidering af nedsatte disulfidbindinger på grund af den varierende redoxtilstand af gelen, og spaltning af aspartyl-prolyl peptidbindinger pga. opvarmning af proteinet i Laemmli-buffer (pH 5,2) ^4,6. bis-tris gelsystem, der opererer på en neutral pH-værdi (7,0), giver betydelige fordele over Lamemmli systemet. Dette system forbedrer protein stabilitet, minimerer protein modifikationer, vedligeholder proteiner i deres reducerede stater, forhindrer aspartyl-prolyl spaltning under elektroforese, og endnu vigtigere, det elektroforese køre tid er 35 min ^4,6,7. Desuden than Bis-Tris gelsystem producerer også skarpere bands, højere opløsning og separation, og øget følsomhed resulterer i mere pålidelige data ^4.

I forbindelse med Bis-Tris-gel system, iBlot tør blotting system bruger høj feltstyrke og strømme til at reducere overførsel tid af proteiner fra geler på membraner inden 7 min ^8. Denne overførsel er baseret på tør blotting metode, der frembringer en mere effektiv og pålidelig overførsel af proteiner ^8. For en detaljeret sammenligning af effekten af iBlot transfersystem til de konventionelle overførselssystemer henvises til følgende websted: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Det udnytter en anode og katode stak, som består af en gelmatrix, der indeholder de relevante transfer buffere, der fungerer som ion reservoirer ^8. Under overførslen vand elektrolyse med til at forhindre dannelsen af ilt fra kobber anode resulterer i en mere ensartet protein overførsel uden at forårsage band forvrængning ^8. Desuden er denne transfersystemet også øger overførselshastigheden ved at reducere afstanden mellem elektroderne ^8.

Selvom kemoluminescens er den mest almindelige og traditionelle teknik for protein detektion af Western blot-analyser, to-farvet infrarødt fluorescerende afsløring forbedrer følsomheden, kvalitet og nøjagtigheden af ​​Western blot data. Denne påvisningsmetode bruger infrarød laser excitation i to optimale bølgelængder, 700 nmog 800 nm for at danne et klart billede af data med den største signal-til-støj-forholdet og højeste følsomhed ^9. Således kan to målproteiner visualiseres samtidigt på den samme membran ved hjælp af 700 nm og 800 nm fluorescerende detektion kanaler. Endnu vigtigere er, linearitet og dynamiske område af infrarød fluorescens giver præcis kvantitativ analyse af både stærke og svage proteinbåndene ^9. Desuden er denne protokol giver enorme fordele og forbedringer i forhold til den klassiske Western blotting teknik ved at mindske elektroforese og overførsel gange af dette eksperiment uden at kompromittere effekten af ​​disse processer og udnytte infrarød fluorescerende protein opdagelse til at producere større kvalitative og kvantitative Western blot data.

Protocol

1.. Fremstilling af helcellelysater fra cellekultur Placer celledyrkningsskåle på is og tilsæt koldt PBS med 5 mM EDTA (fx 5 ml PBS med 5 mM EDTA/10 cm 2 plade). Fjern adhærente celler fra skålen ved hjælp af en celleskraber og derefter overføre cellesuspensionen til en kold 15 ml konisk rør. Pelleter cellesuspensioner ved lav hastighed centrifugering ved 1.000 rpm (230 x g) i 5 minutter ved 4 ° C. Placer koniske rør på is og omhyggeligt aspirere supernatanten uden at …

Representative Results

To-farve infrarød fluorescens registrerer både stærke og svage bånd på den samme membran med forbedret følsomhed og den højeste signal-til-støj-forhold for at producere klare Western blot billeder. Typiske resultater genereret af tofarvede Western blotdetektion visualiseret i både 700 nm og 800 nm fluorescerende kanaler er eksemplificeret i figur 1 og 2.. Den øverste Western blot i Figur 1 viser den samtidige (overlay) påvisning af den samlede ERK1 / 2 med 80…

Discussion

De kritiske trin i at skabe høj kvalitet, kvantitative Western blots i henhold til denne protokol, er følgende: 1) måling af protein-koncentrationer, 2) prøveforberedelse, 3) at blokere membranen og 4) kvalitet og kaliber af det primære antistof.

Nøjagtigheden af ​​måling af det samlede protein-koncentrationer kan have en stor indvirkning på kvantificere proteinbåndene da den usædvanlige følsomhed infrarødt fluorescerende afsløring vil forstærke eventuelle små forskelle, d…

Materials

BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A