टाउन में पश्चिमी सबसे तेज: क्लासिक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण पर एक समकालीन मोड़
Summary
इस प्रोटोकॉल पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन में नवीनतम प्रगति की पड़ताल. ये उपन्यास संशोधनों एक 35 मिनट वैद्युतकणसंचलन चलाते समय, एक 7 मिनट ड्राई सोख्ता हस्तांतरण प्रणाली, और उच्च संकल्प, गुणवत्ता, संवेदनशीलता, और पश्चिमी डेटा के बेहतर सटीकता उत्पन्न करता है कि अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने और इमेजिंग के साथ एक बीआईएस-tris जेल प्रणाली को रोजगार.
Abstract
मूल रूप से 1970 के दशक में स्थापित किया गया है कि पश्चिमी धब्बा तकनीक अभी भी सक्रिय रूप से आज का उपयोग किया जाता है. हालांकि, पश्चिमी सोख्ता के इस पारंपरिक विधि कम गुणवत्ता संकल्प, नकली बैंड, संवेदनशीलता की कमी हुई है, और गरीब प्रोटीन अखंडता शामिल है कि कई कमियां हैं. हाल के अग्रिमों काफी उच्च गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा का उत्पादन करने के लिए मानक पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल के कई पहलुओं में सुधार हुआ है. बीआईएस-tris जेल प्रणाली, पारंपरिक Laemmli प्रणाली के लिए एक विकल्प, बेहतर प्रोटीन जुदाई और संकल्प उत्पन्न प्रोटीन अखंडता बनाए रखता है, और एक 35 मिनट चलाने के समय को वैद्युतकणसंचलन कम कर देता है. इसके अलावा, iBlot ड्राई सोख्ता प्रणाली में नाटकीय रूप से अक्सर लंबा हस्तांतरण के समय के साथ अधिक अक्षम हैं कि परंपरागत प्रोटीन हस्तांतरण के तरीकों के विपरीत है जो 7 मिनट में झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण की प्रभावकारिता और गति में सुधार. इन उच्च अभिनव संशोधनों, प्रोटीन डी के साथ संयोजन मेंetection, उच्च गुणवत्ता वाले अवरक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग परिणामों का उपयोग अधिक सटीक और chemiluminescence के मानक पश्चिमी सोख्ता तकनीक की तुलना में लगातार डेटा. यह तकनीक एक साथ विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों में दिखाए जा रहे हैं कि दो रंग लगभग अवरक्त रंगों के उपयोग के द्वारा एक ही झिल्ली पर दो अलग एंटीजन पता लगा सकते हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट इमेजिंग के linearity और व्यापक गतिशील रेंज मजबूत और कमजोर दोनों प्रोटीन बैंड की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल बहुत इस प्रयोग का प्रदर्शन समय को कम करते हुए इन प्रगति काफी डेटा की गुणवत्ता को बढ़ाने में जो क्लासिक पश्चिमी सोख्ता विधि, के लिए महत्वपूर्ण सुधार का वर्णन करता है.
Introduction
पश्चिमी सोख्ता की तकनीक पहले एंटीबॉडी 1-3 का उपयोग प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक बेहतर तरीका बनाने के लिए 1977 और 1979 के बीच विकसित किया गया था. यह प्रक्रिया माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना और autoradiography, यूवी प्रकाश, या एक peroxidase प्रतिक्रिया उत्पाद 3 से पता लगाया लक्ष्य प्रोटीन के साथ एसडीएस पृष्ठ जैल से झिल्ली प्रोटीन के electrophoretic स्थानांतरण का उपयोग किया. इस प्रकार, एक ही इन बुनियादी सिद्धांतों अभी भी व्यापक रूप से आज के पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है. हालांकि, इस क्लासिक पश्चिमी सोख्ता तकनीक जैसे धीमी गति से वैद्युतकणसंचलन चलाते समय, कम संकल्प और कृत्रिम प्रोटीन का बैंड, प्रोटीन गिरावट के लिए संवेदनशीलता, और सीमित संवेदनशीलता के साथ ही गरीब डेटा गुणवत्ता 4 के रूप में उपस्थित कई नुकसान करता है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल और अधिक सटीक गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करता है कि मानक पश्चिमी धब्बा प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण प्रगति और सुधार का वर्णन करता है.
"> एसडीएस पृष्ठ का उपयोग प्रोटीन की एक विस्तृत रेंज को अलग करने के लिए Laemmli प्रणाली इस पश्चिमी सोख्ता प्रणाली की लोकप्रियता के बावजूद. पश्चिमी सोख्ता 5 के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल जेल प्रणाली है, इस पद्धति बैंड विरूपण, संकल्प की कमी है, और कर सकते हैं परिणाम नकली बैंड 4. यह अलग करने जेल, कम डाइसल्फ़ाइड जेल के अलग redox राज्य की वजह से बांड, और aspartyl-prolyl की दरार की reoxidation की उच्च पीएच (9.5) की वजह से प्रोटीन की deamination और alkylation का परिणाम हो सकता है Laemmli बफर (5.2 पीएच) 4,6 में प्रोटीन हीटिंग की वजह से पेप्टाइड बांड., एक तटस्थ पीएच (7.0) पर चल रही है Lamemmli प्रणाली से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है जो बीआईएस-tris जेल प्रणाली,. इस प्रणाली प्रोटीन स्थिरता, minimizes को बेहतर बनाता है प्रोटीन संशोधनों, उनके कम राज्यों में प्रोटीन का कहना है वैद्युतकणसंचलन दौरान aspartyl-prolyl दरार से बचाता है, और अधिक महत्वपूर्ण बात, वैद्युतकणसंचलन चलाते समय टी, इसके अलावा. 35 मिनट 4,6,7 हैवह बीआईएस-tris जेल प्रणाली भी अधिक विश्वसनीय डेटा 4 में जिसके परिणामस्वरूप तेज बैंड, उच्च संकल्प और जुदाई, और वृद्धि की संवेदनशीलता पैदा करता है.बीआईएस-tris जेल प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में, iBlot ड्राई सोख्ता प्रणाली काफी 7 मिनट 8 भीतर झिल्ली पर जैल से प्रोटीन के हस्तांतरण के समय को कम करने के लिए उच्च शक्ति क्षेत्र और धाराओं का उपयोग करता है. इस हस्तांतरण प्रणाली प्रोटीन 8 के एक अधिक कुशल और विश्वसनीय हस्तांतरण उत्पन्न करता है कि शुष्क सोख्ता पद्धति पर आधारित है. : पारंपरिक हस्तांतरण प्रणाली के लिए iBlot हस्तांतरण प्रणाली की प्रभावोत्पादकता की एक विस्तृत तुलना के लिए निम्नलिखित वेबसाइट को देखें http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . यह आयन जलाशयों 8 के रूप में कार्य है कि उपयुक्त स्थानांतरण बफ़र्स, जिसमें वह एक जेल मैट्रिक्स के शामिल हैं जो एक anode और कैथोड पर ढेर, का इस्तेमाल करता. स्थानांतरण के दौरान, पानी इलेक्ट्रोलिसिस बैंड विरूपण 8 कारण के बिना एक और अधिक सुसंगत प्रोटीन हस्तांतरण में जिसके परिणामस्वरूप तांबा एनोड से ऑक्सीजन की पीढ़ी को रोकने में मदद करता है. इसके अलावा, इस हस्तांतरण प्रणाली भी इलेक्ट्रोड 8 के बीच की दूरी को कम करने से स्थानांतरण गति बढ़ जाती है.
Chemiluminescence वेस्टर्न ब्लॉट के प्रोटीन का पता लगाने के विश्लेषण के लिए सबसे आम और पारंपरिक तकनीक है, दो रंग अवरक्त फ्लोरोसेंट का पता लगाने में काफी पश्चिमी धब्बा डेटा की संवेदनशीलता, गुणवत्ता, और सटीकता में सुधार. यह पता लगाने की विधि दो इष्टतम तरंग दैर्ध्य 700 एनएम में अवरक्त लेजर उत्तेजना का उपयोग करता हैऔर 800 एनएम, सबसे बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात और उच्चतम संवेदनशीलता 9 के साथ एक स्पष्ट डेटा छवि उत्पन्न करने के लिए. इस प्रकार, दो लक्ष्य प्रोटीन 700 एनएम और 800 एनएम फ्लोरोसेंट का पता लगाने चैनलों का उपयोग कर एक ही झिल्ली पर एक साथ देखे जा सकते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, अवरक्त प्रतिदीप्ति के linearity और गतिशील रेंज मजबूत और कमजोर दोनों प्रोटीन बैंड 9 की सटीक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल इन प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता समझौता किए और अधिक गुणात्मक और मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा डेटा का उत्पादन करने के लिए अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के उपयोग के बिना इस प्रयोग की वैद्युतकणसंचलन और हस्तांतरण के समय कम से क्लासिक पश्चिमी सोख्ता तकनीक पर जबरदस्त फायदे और सुधार प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के अनुसार उच्च गुणवत्ता, मात्रात्मक पश्चिमी blots पैदा करने में महत्वपूर्ण कदम का अनुसरण कर रहे हैं: 1) प्रोटीन सांद्रता को मापने, 2) नमूना तैयार करने, 3) झिल्ली अवरुद्ध और, 4) प्राथमिक एंटीबॉडी की …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी सहायता और समर्थन के लिए मैकमोहन प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध में एक NIH / NCI R01 CA176839-01 (एम एम) और एक संस्थागत अनुसंधान और अकादमिक कैरियर विकास पुरस्कार (जे एस के लिए IRACDA) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 |
| 4x NuPAGE® LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 |
| 10x NuPAGE® Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 |
| 20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 |
| NuPAGE® Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX |
| SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 |
| XCell SureLock® Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 |
| iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 |
| iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 |
| iBlot® Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 |
| β-Actin | Sigma | A2228 |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 |
| Odyssey® Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 |
| Odyssey® Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A |
| Odyssey® Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
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