Den raskeste Western i byen: en moderne vri på den klassiske Western Blot analyse

Summary

Denne protokollen utforsker de siste fremskritt i å utføre Western blot analyser. Disse nye endringer benytter en Bis-Tris-gel-system med en 35 min elektroforese kjøretid, en 7 min tørrblotting overføringssystem, og infrarødt fluorescerende protein deteksjon og avbildning som genererer høyere oppløsning, kvalitet, følsomhet og forbedret nøyaktighet for Western-data.

Abstract

Western blott teknikker som opprinnelig ble etablert på slutten av 1970-tallet er fortsatt aktivt utnyttet i dag. Men denne tradisjonelle metoden for Western blotting har flere ulemper som inkluderer lav kvalitet oppløsning, falske band, nedsatt følsomhet, og dårlig protein integritet. Nylige fremskritt har drastisk forbedret mange aspekter av standard Western blot-protokollen til å produsere høyere kvalitative og kvantitative data. Den Bis-Tris-gel-system, et alternativ til den konvensjonelle Laemmli-systemet genererer bedre protein separasjon og oppløsning, opprettholder protein integritet, og reduserer elektroforese i en 35 min kjøretid. Videre iBlot tørrblotting systemet, forbedrer dramatisk effekt og hastighet av proteinoverføring til membranen i 7 minutter, noe som er i motsetning til de tradisjonelle protein overføringsmetoder som ofte er mer ineffektive med lengre overføringstider. I kombinasjon med disse svært innovative modifikasjoner, protein detection hjelp av infrarøde fluorescerende imaging resultater i høyere kvalitet, mer nøyaktig og konsistente data i forhold til standard Western blotting teknikk kjemiluminiscensen. Denne teknologien kan samtidig oppdage to forskjellige antigener på samme membranen ved å benytte to-farge nær-infrarød fargestoffer som er visualisert i ulike fluorescerende kanaler. Videre, linearitet og brede dynamiske område for fluoriserende bilde gir mulighet for nøyaktig kvantifisering av både sterke og svake proteinbånd. Dermed beskriver denne protokollen de viktigste forbedringer i den klassiske Western blotting metode, der disse fremskritt i betydelig grad øke kvaliteten på data mens noe som reduserer ytelsen tidspunktet for dette eksperimentet.

Introduction

Teknikken med Western-blotting ble først utviklet mellom 1977 og 1979 for å skape en bedre metode for detektering av proteiner ved å bruke antistoffer ^1-3. Denne fremgangsmåten benyttes elektrooverføring av proteiner til membraner fra SDS-PAGE-geler med mål-proteinene visualisert ved hjelp av sekundære antistoffer og detektert ved autoradiografi, UV-lys, eller en peroksydase reaksjonsprodukt ^3.. Dermed er de samme grunnleggende prinsippene fortsatt mye brukt i dagens vestlige blot protokoller. Men, gjør denne klassiske Western blotting teknikk presentere mange ulemper, som langsom elektroforese kjøre ganger, lav oppløsning og kunstige protein band, mottakelighet for proteinnedbrytning, og begrenset følsomhet samt dårlig datakvalitet ^fire. Derfor beskriver denne protokollen betydelige fremskritt og forbedringer til standarden Western blot prosedyre som genererer mer nøyaktige kvalitative og kvantitative data.

"> Den Laemmli-systemet for separering av en rekke proteiner ved hjelp av SDS-PAGE er det mest brukte gel system for Western ^blot-5. Tross populariteten til denne Western blot-system, kan denne fremgangsmåte resultere i bandet forvrengning, tap av oppløsning, og falske bånd ^4. Dette kan være en konsekvens av den deaminering og alkylering av proteiner på grunn av den høye pH-verdi (9,5) for separering av gelen, Reoksydasjon av reduserte disulfidbindinger på grunn av den varierende redox state of the gel, og spalting av aspartyl-prolyl peptidbindinger på grunn av oppvarming av proteinet i Laemmli-buffer (pH 5,2) ^4,6. The Bis-Tris gel system, som opererer ved en nøytral pH (7,0), gir betydelige fordeler over Lamemmli system. Dette systemet forbedrer proteinstabilitet, minimerer protein modifikasjoner, opprettholder proteiner i deres reduserte stater, hindrer aspartyl-prolyl cleavage under elektroforese, og enda viktigere, er elektroforese kjøretid 35 min ^4,6,7. I tillegg than Bis-Tris gel systemet produserer også skarpere band, høyere oppløsning og separasjon, og økt følsomhet resulterer i mer pålitelige data ^4.

I forbindelse med Bis-Tris-gel-system, bruker iBlot tørrblotting system med høy styrke og strømmer felt for å redusere overføringstiden av proteiner fra gelene på membranene i løpet av 7 min ^8. Dette overføringssystemet er basert på tørrblotting metode som genererer en mer effektiv og pålitelig overføring av proteiner ^8. For en detaljert sammenligning av effekten av iBlot overføringssystemet til de konvensjonelle overføringssystemer henvises det til følgende nettsted: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Det benytter en anode-og katode-stakken, som består av en gel-matrise som inneholder de aktuelle overføringsbuffere, som fungerer som ion-reservoar ^8. Under overføringen, bidrar til vannelektrolyse for å forhindre genereringen av oksygen fra kobberanode som resulterer i en mer jevn overføring av protein uten å forårsake forvrengning båndet ^8.. Videre har denne overføringssystem øker også overføringshastigheten ved å redusere avstanden mellom elektrodene ^8.

Selv kjemiluminescens er den vanligste og tradisjonell teknikk for påvisning av protein Western blot-analyser eller to farger infrarøde fluorescerende påvisning forbedrer følsomheten, kvaliteten og nøyaktigheten av Western blot data. Denne oppdagelsen metoden bruker infrarød laser eksitasjon i to optimale bølgelengder, 700 nmog 800 nm, for å generere et klart bilde av data med den største signal-til-støy-forhold og høy følsomhet ^9.. Således kan to mål proteiner visualiseres samtidig på samme membran ved bruk av 700 nm og 800 nm fluorescerende deteksjonskanaler. Enda viktigere, linearitet og dynamiske området for infrarøde fluorescens tillater presis kvantitativ analyse av både sterke og svake proteinbånd ^9. Videre gir denne protokollen enorme fordeler og forbedringer i forhold til klassiske Western blot-teknikk ved å redusere elektroforese og overføring ganger av eksperimentet uten at effektiviteten av disse prosessene, og å benytte infrarødt fluorescerende protein deteksjon til å produsere større kvalitative og kvantitative Western blot data.

Protocol

En. Preparation of Whole Cell Lysater fra Cell Culture Plasser celle kultur retter på is og kaldt PBS med 5 mM EDTA (f.eks 5 ml PBS med 5 mM EDTA/10 cm to plate). Fjern adherente celler fra fatet ved hjelp av en celleskrape og deretter overføre cellesuspensjonen til en kald 15 ml konisk rør. Pellet cellesuspensjoner med lav-hastighetssentrifugering ved 1000 rpm (230 x g) i 5 min ved 4 ° C. Plasser koniske rør på is og forsiktig suge supernatanten uten å forstyrre pelleten….

Representative Results

To-farge infrarød fluorescens detekterer både sterke og svake bånd på samme membran med forbedret sensitivitet og det høyeste signal-til-støy-forhold for å produsere klare Western blot-bilder. Typiske resultater fra to-farge Western blot deteksjon visualisert i både 700 nm og 800 nm fluoriserende kanaler er eksemplifisert i figurene 1 og 2. Den øverste Western blot i figur 1 viser den samtidige (overlay) deteksjon av total ERK1 / 2 under 800 nm kanalen (grønn)…

Discussion

De kritiske trinn i generering av høy kvalitet kvantitative Western-blotting i henhold til denne protokollen er følgende: 1) måling av proteinkonsentrasjon, 2) prøvepreparering, 3) blokkere membranen og, 4) kvalitet og kaliber av det primære antistoff.

Nøyaktigheten måle totale proteinkonsentrasjonen kan ha en stor innvirkning på å kvantifisere protein band siden den eksepsjonelle følsomheten infrarød fluorescerende deteksjon vil forsterke noen små forskjeller som finnes i protei…

Materials

BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A