En hurtig og modulær protokol for generering af rekombinante vacciniavirus, der udtrykker fluorescerende mærkede proteiner samtidig ved hjælp af metoden til forbigående dominerende udvælgelse, er beskrevet her.
Mærkning af virale proteiner med fluorescerende proteiner har vist sig at være en uundværlig tilgang til at fremme vores forståelse af virus-vært interaktioner. Vacciniavirus (VACV), den levende vaccine, der anvendes til udryddelse af kopper, kan især tilskrives fluorescerende mikroskopi i levende celler på grund af dens store virionsstørrelse og den lethed, hvormed den kan konstrueres på genomniveau. Vi rapporterer her en optimeret protokol til generering af rekombinante vira. De minimale krav til målrettet homolog rekombination under vaccinia replikation blev bestemt, hvilket gør det muligt at forenkle konstruktionsgenereringen. Dette gjorde det muligt for alliancen af forbigående dominerende udvælgelse (TDS) med en fluorescerende reporter og metabolisk udvælgelse at give en hurtig og modulær tilgang til fluorescerende etiket virale proteiner. Ved at strømline generering af fluorescerende rekombinante vira, er vi i stand til at lette downstream applikationer såsom avanceret billedbehandling analyse af mange aspekter af virus-host samspil, der opstår under virus replikering.
Vaccinia virus (VACV) er prototypisk poxvirus og stærkt relateret til variola virus, det forårsagende middel af kopper. Begge disse vira er medlemmer af orthopox slægten, der omfatter andre bemærkelsesværdige patogener såsom monkeypox og ectromelia virus (mousepox)1. Orthopoxvirus har store dobbeltstrengede DNA-genomer (180-220 kb), der koder op mod 200 forudsagte åbne læserammer2,3. Replikering af disse vira indebærer dannelsen af en perinuklear virusfabrik, hvor modne vira (MV) fremstilles, og trans-Golgi-netværket, hvor en delmængde af MV erhverver to ekstra membraner til at generere indpakkede vira (WV) (gennemgået af Roberts og Smith4). Orthopox genomer er meget modtagelige for genmanipulation på grund af den høje grad af genetisk rekombination, der er et træk ved VACV genomreplikation og formidles af den virale DNA polymerase5. Generering af rekombinante vira er afhængig af homolog rekombination og lineære DNA-molekyler med homologier så små som 12 bp er tilstrækkelige til at mægle rekombination i vaccinia virusinficerede celler6. Fluorescerende mærkning af vacciniavirus kan give ekstremt lyse viruspartikler på grund af orthopoxpartiklernes store størrelse, hvilket gør det muligt at inkorporere mange fluorescerende proteiner pr. Virion7. Vaccinia har kapacitet til at bære store fragmenter af udenlandsk DNA8, og desuden kan manglen på stiv kapitidsymmetri tillade en vis fleksibilitet, når de udtrykker virale proteingenfusioner fra deres endogene loci9. Fluorescerende mærkning af VACV-proteiner har vist sig at være uvurderlig for undersøgelsen af interaktioner mellem vært og patogen på subcellulært niveau, navnlig inden for virusindtræden10, transport11-13og morfogenese , især af indpakkede virions7.
Rekombinant virus kan vælges ved redning af en svækket vækst fænotype14,15, metabolisk udvælgelse16-18, eller ved udtryk for en markør gen (f.eks X-gal19 eller fluorescerende protein13,20). Her beskriver vi udvælgelsen af fluorescerende vira ved hjælp af en kraftig kombination af fluorescerende og metabolisk udvælgelse. Forbigående dominerende udvælgelsesvektorer (TDS), udviklet af Faulkner og Moss (1990)21, gør det muligt at integrere markører sammen med det ønskede fluorescerende mærkede gen af interesse. Når metabolisk udvælgelse fjernes, kan der forekomme en sekundær rekombinationshændelse, som punktafgifter udvælgelsesgener, men efterlader det fluorescerende mærkede virusprotein intakt. Figur 2 nedenfor giver et overblik over forsøgsproceduren. De udvælgelsesgener, der anvendes i denne undersøgelse, er mCherry og Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase(gpt) genet,begge udtrykt fra en syntetisk tidlig / sen viral promotor og brugt tidligere af Cordeiro et al. 22 Desuden er der fluorescens af det mærkede fusionsprotein af interesse. Når metabolisk udvælgelse fjernes, fjernes de valgbare markører (mCherry og gpt), så kun det mærkede gens fluorescens efterlades, hvilket gør det muligt at identificere de korrekte rekombinante vira. Udskæringen af udvælgelsesmarkørerne giver mulighed for at kombinere flere fluorescerende tags, så vi kan skabe vira med evnen til at fluorescerende mærke flere virale proteiner samtidigt. Tidligere undersøgelser har bestemt de minimale homologiske krav til vaccinia rekombination af lineære og cirkulære DNA-molekyler, der er omdannet til vaccinia virusinficerede celler6. Vi ønskede at bestemme rekombination effektivitetsgevinster af varierende homologi længder af flankerende arme i gpt-mCherry TDS vektor gennem dens inkorporering i vaccinia virale genom. Det blev fastslået, at homologe regioner på 100 basispoint i TDS-vektoren er tilstrækkelige til at målrette og mægle i indsættelsen af rekombinant DNA i VACV-genomet ved homolog rekombination (figur 4). Mens mindre homologi længder også ville muliggøre rekombination, 100 bp homologi længder forudsat nok rekombinant virus, der let kunne identificeres med metaboliske og fluorescerende udvælgelse. DNA-fragmenter af denne størrelse kan kommercielt syntetiseres til relativt lave omkostninger og letter i høj grad produktionen af flere vektorer til oprettelse af rekombinante vira. Vi valgte at øge homologilængden til 150 basispoint for at give større rekombinationsfrekvens, samtidig med at vi holdt omkostningerne ved syntesen af oligonukleotidsekvensen i flankerende regioner nede.
Denne teknik beskriver en effektiv og modulær protokol til oprettelse af rekombinante vira, der udtrykker fluorescerende mærkede virale proteiner. Metoden sikrer, at den eneste ændring af det virale genom er tilføjelsen af et mærke eller en markør, der ikke efterlader nogen markeringsmarkører. Den korte armlængde, der kræves til homolog rekombination, muliggør dens direkte syntese, hvilket eliminerer flere tidskrævende runder pcr og kloning, mens fluorescensen af mCherry og metabolisk GPT-udvælgelse bruges til at isolere viral rekombinations intermediates. Disse mellemprodukter kan efter fjernelsen af udvælgelsen løses til en virus med et mærket gen eller tilbage til forældretypen. En lignende metode, der indebærer anvendelse af både fluorescerende og metabolisk udvælgelse, er blevet beskrevet tidligere27, selv om den metode, der anvendes i denne undersøgelse, anvender kortere, syntetiserede homologiske regioner, hvilket gør det muligt at identificere det ønskede rekombinante virus ved at billed fluorescensen af det mærkede gen af interesse. Denne sekundære udvælgelse gælder kun for mærkning af stærkt udtrykte virale gener, der producerer tilstrækkelig fluorescens i en plakanalyse. Alternativt kunne man forestille sig indsættelse af en komplet ekspressionskassette, for eksempel et fluorescerende protein under en stærk viral promotor. I dette tilfælde ville venstre og højre arme definere indsætningspunktet i stedet for det virale gen, der skal mærkes.
Der er nogle vigtige trin, der viste sig nyttige under forsøgsproceduren. Det ovenfor beskrevne flydende overlay i trin 2.3.3 viste sig at være afgørende for påvisning og isolering af røde/grønne lysstofrør. Vi mener, at kombinationen af GPT udvælgelse reagenser og agarose overlay afskrækket væksten af rekombinant virus og derfor skiftede til en flydende overlay for det første skridt af forstærkende vira efter transfekt. Det er også vigtigt at vælge fluorescerende plaques, der viser lokaliseret tagfarve fluorescens til berigelse og rensning, da mellemprodukter som følge af rekombination af venstre arm kan resultere i diffus fluorescens observeret i plaques, hvis venstre arm også indeholder en promotorsekvens. MCherry-markørgenet i TDS-vektoren kan også erstattes af gfp, for eksempel for at give mulighed for nem inkorporering og valg af mCherry som et fluorescerende tag.
Nogle teknikker, der er beskrevet ovenfor, varierer lidt fra etablerede metoder til at skabe rekombinant vacciniavirus. For eksempel er MOI af virus, der bruges til at skabe rekombinanter, normalt mindre end 128, men brugen af højere MOI’er har været tilstrækkelig til oprettelse af rekombinant vacciniavirus ved denne metode. Brugen af GPT-udvælgelsesreagenser kræver normalt forbehandling af cellerne med udvælgelsesreagenser18, men hvis de tilføjes under redningsfasen efter infektionen, er der stadig tilstrækkeligt udvalg af de ønskede rekombinanter, især på grund af tilstedeværelsen af en fluorescerende markeringsmarkør.
Som tidligere nævnt er en af begrænsningerne ved denne teknik, at det sekundære fluorescensvalgstrin er afhængig af, at det mærkede protein af interesse udtrykkes højt på et niveau, der gør det muligt at detektere det med øjet i en plakanalyse. Uden dette ville det være muligt at rense vira, der kun udviste mCherry-fluorescens, hvoraf mindst 50% ville indeholde de ønskede rekombinante vira, som kunne identificeres ved molekylære strategier som PCR beskrevet i trin 2.12 ovenfor. En anden begrænsning kunne være inaktivering af visse proteiner som følge af deres mærkning. Det fluorescerende mærke kan gennemgå mutationer eller blive fjernet af rekombinant virus med passaging over tid. Derfor anbefales regelmæssig prøveudtagning af rekombinante viruslagre ved mikroskopi og PCR. Endelig kan der være en grænse for antallet af fluorescerende mærkede proteiner, der kan indarbejdes i en enkelt virus. Et aspekt af dette er evnen til at visualisere dem alle samtidigt; I betragtning af emissionsspektre af tilgængelige lysstofrør er det vigtigt at udvælge dem omhyggeligt for at sikre minimal spektralblødning. Derudover åbner brug af nært beslægtede tags som GFP og Cerulean muligheden for rekombination mellem de to, afhængigt af deres placeringer i det rekombinante genom.
Den modulære karakter af denne teknik gør det muligt at erstatte fluorescerende tags baseret på kompatibilitet med andre farvning og / eller tag valg. Ved at ekscisere markører, der kan vælges, giver TDS-metoden mulighed for seriel tilsætning af forskellige fluorescerende proteiner eller kombination af TDS-baseret mærkning med TDS-baserede gensletninger til fænotypiske analyser29. Som et eksempel på nytten af denne tilgang blev der genereret en dobbeltmærket fluorescerende virus, der mærker viruskerner og WV-membranen. Imaging undersøgelser med denne virus kan bruges til at studere bevægelse, morfogenese og indpakning af virus under virus replikation. Endnu ukarakteriserede vaccinia virale proteiner kan også mærkes og studeres ved denne teknik.
Vaccinia virus er blevet flittigt brugt i billeddiagnostiske undersøgelser på grund af mange egenskaber ved virus, der er gunstige for levende celle mikroskopi. Fluorescerende tags udtrykkes fra det virale genom, hvilket eliminerer behovet for transfekt, hvilket gør det muligt let at analysere primære celler fra inficerede dyr eller ikke-transfektable celler. I første omgang, fluorescerende VACVs blev brugt til simple subcellulære sporing af virus bevægelse30, men nyere tilgange har udvidet deres nytte til at omfatte FRET undersøgelser31, FRAP på enkelt virus partikler32, promotor reportere33, intravital imaging34, og strukturelle undersøgelser35-37. Alle disse teknikker kunne være inden for lettere og tættere rækkevidde kombineret med denne metode til at skabe rekombinante fluorescerende vira.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af The Australian Research Council Federation Discovery Project tilskud #1096623.
Mycophenolic acid | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | Dissolve in 0.1N NaOH |
Xanthine | Sigma-Aldrich | X0626-5G | Dissolve in 0.1N NaoH |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |