एक संशोधित वर्षा विधि मूत्र Exosomes अलग करने के लिए
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
मूत्र exosomes miRNAs 1 के लिए समृद्ध होना दिखाई देते हैं कि मूत्र निकासी प्रणाली अस्तर केशिकागुच्छीय podocytes, गुर्दे की छोटी नली कोशिकाओं और कोशिकाओं सहित मूत्र अंतरिक्ष में सामान्य और रोग की स्थिति के तहत सभी प्रकार की कोशिकाओं से व्युत्पन्न multivesicular निकायों (MVB) के 100 एनएम के छोटे आंतरिक पुटिकाओं हैं -2। कई शोधकर्ताओं ने स्वस्थ व्यक्तियों के मूत्र के रूप में अच्छी तरह से गुर्दे और / या व्यवस्थित रोगों 3-5 के साथ उन लोगों से अलग exosomes में विशिष्ट प्रोटीन का पता चला है। Exosomes ultracentrifugation 8-9, या वर्षा 10-11 के साथ nanomembrane फिल्टर के संयोजन, इस तरह के साथ या सूक्रोज 6-7 बिना दो कदम अंतर ultracentrifugation के रूप में विभिन्न तरीकों का उपयोग कर अलग किया जा सकता है। हमने हाल ही में मूत्र exosomes अलग और miRNA और प्रोटीन बायोमार्कर 11 का पता लगाने के लिए एक सरल, तेज, स्केलेबल और प्रभावी तरीका विकसित किया है। बायोमार्कर विभिन्न जैविक तरल पदार्थ की एक किस्म में पता लगाया जा सकता है, उरine यह एक अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव तरीके से बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि गुर्दे और मूत्र पथ के रोगों के साथ रोगियों के लिए सबसे सुविधाजनक विकल्प है।
मूत्र exosomes 6-11 अलग करने के लिए कई तरीके हैं हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रक्रिया एक 30% sucrose के तकिया के साथ अंतर ultracentrifugation पर निर्भर करता है। इस विधि के कुशल है और इस प्रक्रिया के साथ पृथक जिसके परिणामस्वरूप exosomes की गुणवत्ता उच्च है, तकनीक ही कुशल कर्मियों की आवश्यकता है और समय लेने वाली है, कई ultracentrifugation चरणों की आवश्यकता होती है। ऐसे निस्पंदन और वर्षा के रूप में अन्य तरीकों, एक मालिकाना वर्षा अभिकर्मक का उपयोग करता है कि एक सहित, exosomes के अलगाव के लिए विकसित किया गया है (यानी, ExoQuick-तृकां: सिस्टम बायोसाइंसेज, माउंटेन व्यू, सीए)। इस अभिकर्मक का उपयोग कर वर्षा तेजी से और अपेक्षाकृत आसान है, हालांकि, पृथक exosomes की पवित्रता ultracentrifugation मेथ की तुलना में कम हैआयुध डिपो। हमने हाल ही में हम हमारी प्रयोगशाला में 11 में विकसित किया है कि ExoQuick-तृकां का उपयोग कर वर्षा विधि के एक संशोधन सहित मूत्र exosomes के अलगाव के लिए छह तरीके हैं, की तुलना में। हम इस संशोधित तेज़ी विधि प्रोटीन, miRNA, और mRNAs और खुद को तेजी से और ultracentrifugation से लागू करने के लिए आसान था प्रक्रिया की उच्च मात्रा झुकेंगे पाया। यहाँ, हम एक stepwise फैशन में हमारे संशोधित तेज़ी विधि का प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और exosome अलगाव के अन्य तरीकों के साथ तुलना में इस तकनीक के फायदे और नुकसान के एक चर्चा शामिल है। संशोधित तेज़ी विधि exosomal प्रोटीन के साथ सहसंबद्ध, और मूत्र से exosome उपज को कम करने के लिए जाना जाता है, जो Tamm-HORSFALL प्रोटीन, को हटाने के बाद exosome कणों की एक शुरुआती तेज़ी, शामिल है। हम इन संशोधनों के मूत्र से exosomal तैयारी की उपज और पवित्रता बढ़ पाया।
Protocol
Representative Results
Discussion
मूत्र से exosomes की तेज़ी से जुड़े अधिकांश विधियों Tamm-HORSFALL प्रोटीन (THP) द्वारा गठित बहुलक नेटवर्क को हटाने का पता नहीं है। इस प्रोटीन यह कथित जाल प्रारंभिक कम गति centrifugation के दौरान exosomes जहां मूत्र में बड़ी मात्रा मे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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