Nanofibre ECM proteine e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato
Summary
Un metodo per ottenere nanofibre e nanostrutture complesse da proteine singole o multiple della matrice extracellulare è descritto. Questo metodo utilizza interazioni proteina-superficie per creare materiali a base di proteine-free-standing con la composizione sintonizzabile e l'architettura per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) nei tessuti è sintetizzato e assemblato da cellule formano un fibrillare 3D, rete proteina strettamente regolata con diametro delle fibre, composizione e organizzazione. Oltre a fornire supporto strutturale, le proprietà fisiche e chimiche del ECM svolgono un ruolo importante in diversi processi cellulari tra cui l'adesione, la differenziazione e apoptosi. In vivo, l'ECM è assemblato esponendo criptico autoassemblaggio (fibrillogenesi) siti all'interno di proteine . Questo processo varia per diverse proteine, ma fibronectina (FN) fibrillogenesi è ben caratterizzato e serve come sistema modello per il montaggio ECM cellulo-mediata. In particolare, le cellule utilizzano i recettori delle integrine sulla membrana cellulare per legare dimeri FN e le forze contrattili actomyosin generati a spiegare ed esporre siti di legame per il montaggio in fibre insolubili. Questo processo mediata dal recettore permette alle cellule di assemblare e organizzare la ECM dal cellulare alla SCA Tissueles. Qui, vi presentiamo un metodo denominato assembly superficie avviato (SIA), che riassume l'assemblaggio matrice cellulo-mediata tramite interazioni proteina-superficie a svolgersi proteine ECM e li assemblano in fibre insolubili. In primo luogo, le proteine ECM sono adsorbiti su un polidimetilsilossano idrofobo (PDMS), superficie dove si parte snaturano (spieghi) ed espongono domini di legame criptici. Le proteine ripiegate vengono poi trasferiti in ben definite micro-e nanostrutture attraverso la stampa microcontact su un poli termoreattiva (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) di superficie. Dissoluzione termicamente attivato il PIPAAm conduce al montaggio finale e il rilascio di nanofibre proteiche insolubili ECM e nanostrutture con geometrie ben definite. Architetture complesse sono possibili ingegneria definiti modelli sulle PDMS timbri utilizzati per la stampa microcontact. Oltre a FN, il processo SIA può essere utilizzato con laminina, fibrinogeno e collagene di tipo I e IV creare multicomponente ECM nanostrucTures. Così, SIA può essere utilizzato per progettare ECM materiali a base di proteine con un preciso controllo della composizione proteica, geometria fibre e architettura scaffold per ricapitolare la struttura e la composizione della ECM in vivo.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) nei tessuti è composto di proteine multifunzionali coinvolte nella regolazione chimici e fisici di processi cellulari multiple comprendenti adesione, proliferazione, differenziazione e apoptosi 1-3. L'ECM è sintetizzato, assemblato, e organizzato dalle cellule e le fibrille proteiche costituenti hanno composizioni uniche, dimensioni delle fibre, geometrie e architetture interconnesse che variano con il tipo di tessuto e stadio di sviluppo. Studi recenti hanno dimostrato che l'ECM può fornire indicazioni istruttive per guidare le cellule a formare tessuti ingegnerizzati 4, suggerendo che ricapitolando l'ECM in termini di composizione e struttura potrebbe consentire lo sviluppo di materiali biomimetici per applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.
Un certo numero di metodi di fabbricazione sono stati sviluppati per ingegnerizzare supporti polimerici che possono mimare aspetti della ECM nei tessuti. Ad esempio, elettrospinning e fase SEPARzione hanno entrambi dimostrato la capacità di formare matrici porose di fibre con diametri da decine di micrometri fino a decine di nanometri 5-7. Entrambe le tecniche hanno anche dimostrato che matrici altamente porosi di nanofibre possono supportare l'adesione cellulare e l'infiltrazione nel impalcatura 8. Tuttavia, questi approcci sono limitati nelle possibili geometrie fibre, orientamenti e 3D architetture che possono essere creati. Electrospinning produce tipicamente ponteggi con fibre orientate sia casuale o altamente allineati, mentre la separazione di fase produce ponteggi a fibre orientate in modo casuale. Vi sono inoltre limitazioni sui materiali, con i ricercatori in genere utilizzando polimeri sintetici, come poli (ε-caprolattone) 8 e acido poli (lattico-co-glicolico) 9, che vengono successivamente rivestite con proteine ECM per promuovere l'adesione cellulare. Biopolimeri naturali sono anche utilizzati, tra cui collagene di tipo I 10, gelatina 11, fibrinogeno 12,chitosano 13, 14 e seta, ma rappresentano solo un piccolo sottoinsieme di proteine trovate in tessuto nativo. La maggior parte dei tessuti contengono un grande ambiente di proteine ECM e polisaccaridi inclusi fibronectina (FN), laminina (LN), collagene di tipo IV e acido ialuronico che sono difficili o impossibili da realizzare nanofibre con metodi esistenti.
Per affrontare questa sfida, abbiamo concentrato i nostri sforzi di ricerca sul imitando il modo in cui le cellule sintetizzano, assemblare e organizzare le fibrille della proteina ECM nel loro ambiente. Mentre il processo fibrillogenesi specifico varia per differenti proteine ECM, tipicamente un cambiamento conformazionale nella molecola proteica ECM è attivata da un enzimatica o interazione recettore-mediata, che espone siti autoassemblaggio criptici. Qui usiamo FN come sistema modello per comprendere meglio il processo di fibrillogenesi. Brevemente, omodimeri FN legano ai recettori di integrina sulla superficie cellulare tramite la sequenza amminoacidica RGD nel 10 tipo IIRipeto unità. Una volta legato, le integrine si allontanano via actomyosin contrazione e si sviluppano i dimeri FN per esporre siti di self-assembly criptici. L'esposizione di questi siti di legame FN-FN permette ai dimeri FN per assemblare in un fibrille insolubili proprio sulla superficie cellulare 15. Lavori in sistemi cell-free ha dimostrato che criptici siti di legame FN-FN possono essere rivelati tramite dispiegarsi con denaturanti 16 o tensione superficiale a un-liquido-solido aria interfaccia 17-19. Tuttavia, le fibre FN creata di queste tecniche sono limitate a dimensioni e geometrie fibre specifiche e sono tipicamente legati ad una superficie.
Qui si descrive un chiamato assieme superficie avviato approccio (SIA) 20 che supera queste limitazioni utilizzando interazioni proteina-superficie per creare posa libera nanofibre insolubili, nanofabrics (fogli 2D) e altre nanostrutture composte da proteine ECM singoli o multipli (Figura 1 ). In questo process, proteine ECM vengono assorbiti da un compatto, conformazione globulare in soluzione e parzialmente denaturato (piegato) su una fantasia, polidimetilsilossano idrofobo (PDMS) timbro. Le proteine ECM vengono poi trasferiti in questo stato su un poli termoreattiva (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) superficie attraverso microcontact stampa 22. Quando idratato con acqua 40 ° C la PIPAAm rimane un solido, ma quando raffreddato a 32 ° C che passa attraverso una temperatura di soluzione critica inferiore (LCST) dove diventa idrofila, si gonfia con acqua e poi si dissolve, rilasciando le nanostrutture ECM assemblati off di la superficie. Il metodo SIA consente di controllare le dimensioni con precisione su scala nanometrica. Controllando parametri chiave quali la composizione, geometria fibra, e l'architettura, è possibile ricapitolare molte proprietà della ECM trovati in vivo e di sviluppare scaffold avanzate per applicazioni di ingegneria tissutale e biotecnologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo SIA presentato qui imita assemblaggio matrice cellulo-mediata e consente la progettazione di ECM nanofibre proteiche e nanostrutture con dimensioni sintonizzabile, l'organizzazione e la composizione. Anche se non identica alla ECM cellule generate, SIA crea ECM composto da nanoscala fibrille della proteina 20 che subiscono piegatura reversibili / spiegamento durante sollecitazioni meccaniche 21 e possono legarsi cellule 20. Ciò fornisce una capacità unica di costruire ECM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno finanziario è stato fornito a JMS dal NIH Biomeccanica in Medicina Rigenerativa Training Program T32 (2T32EB003392), per QJ dal Dowd-ICES Fellowship e AWF da New Innovator Award del direttore NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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