Questo protocollo descrive procedure sperimentali per valutare la differenziazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi in placche di Peyer da progenitori comuni cellule dendritiche, utilizzando tecniche che comportano l'isolamento FACS-mediata delle cellule, il trasferimento genico idrodinamico, e analisi del flusso di sottoinsiemi immuni in placche di Peyer.
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Articolo metodologico
Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dettagli Questo protocollo un metodo per analizzare la capacità di progenitori ematopoietici purificati per generare cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) in cerotto intestinale del Peyer (PP). Progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) sono state purificate dal midollo osseo di topi C57BL6 da FACS e trasferiti a topi riceventi che mancano di una popolazione significativa PDC in PP, in questo caso, IFNAR - / - topi sono stati usati come destinatari di trasferimento. In alcuni topi, l'iperespressione del fattore di crescita delle cellule dendritiche ligando di Flt3 (Flt3L) è stato applicato prima adottivi trasferimento di CDP, utilizzando idrodinamica trasferimento di geni (HGT), del Flt3L-plasmide codificante. Flt3L sovraespressione espande popolazioni DC provenienti dalla trasferiti (o endogeni) progenitori ematopoietici. A 7-10 giorni dopo il trasferimento progenitore, pDCs che nascono dai progenitori adoptively ceduti sono stati distinti da cellule riceventi sullabase di espressione marcatore CD45, con pDCs da CDP trasferiti essere CD45.1 + e destinatari di essere CD45.2 +. La capacità di CDP trasferiti a contribuire alla popolazione pDC in PP e di rispondere alle Flt3L è stata valutata mediante citometria a flusso di PP sospensioni di cellule singole da topi riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per verificare se altre popolazioni progenitrici sono in grado di generare PP pDCs. Inoltre, questo approccio potrebbe essere utilizzato per esaminare il ruolo dei fattori che si prevede di influenzare lo sviluppo PDC in PP, trasferendo sottoinsiemi progenitrici con un atterramento opportuno, knockout o sovraespressione del fattore putativo di sviluppo e / o manipolando citochine circolanti via HGT . Questo metodo può anche permettere un'analisi di come pDCs PP influenzano la frequenza o la funzione di altri sottoinsiemi immuni in PP. Una caratteristica unica di questo metodo è l'uso di IFNAR - / - mice, che mostrano gravemente impoverito PP pDCs relative al tipo di animali selvatici, così allowing ricostituzione di PP pDCs in assenza di effetti confondenti da irradiazione letale.
Introduzione
Qui, dimostriamo un protocollo per valutare se progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP) sono in grado di dare luogo alla cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC), la popolazione in patch di Peyer (PP). L'obiettivo generale di questo metodo è stato quello di valutare la regolamentazione dello sviluppo di pDCs in patch di Peyer (PP pDCs). Il motivo per questo è importante è che pDCs PP differiscono da pDCs trovati in altri tessuti, compreso il midollo osseo, sangue e milza, e pertanto non è chiaro se pDCs PP e altre popolazioni PDC sono evolutivamente e / o funzionalmente connesse. In particolare, pDCs sono ampiamente conosciuto per essere il principale ti....
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Protocollo
Approvazione istituzionale deve essere ottenuto in anticipo per tutte le manipolazioni sperimentali qui descritte coinvolgono topi. Questi includono l'uso di topi C57BL6 per l'isolamento di cellule progenitrici del midollo osseo, IFNAR - / - topo come destinatari per trasferimento adottivo di progenitori emopoietici e l'uso di HGT per citochine sovraespressione in vivo. Un alloggio adeguato e la cura degli animali devono essere forniti anche dallo sperimentatore o istituzione. Inoltre, l'approvazione istituzionale può essere richiesta per i plasmidi usati nel trasferimento genico idrodinamico (cioè approvazione DN....
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Risultati
I nostri risultati mostrano la strategia di gating per l'isolamento di CDP da cellule di midollo osseo del topo (Figura 1), come descritto nei protocolli 2 e 3. CDPs costituiscono circa il 0,1% del totale delle cellule del midollo osseo, e circa 4-6 x 10 4 CDP possono essere isolate da un mouse. Al momento del trasferimento adottivo, CDP si differenziano in pDCs e CDC 10.
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Discussione
La tecnica qui descritta trasferimento adottivo valutato il contributo della CDP alla popolazione PP pDC in topi riceventi che sono carenti in PP pDCs (es IFNAR - / - topi). In esperimenti futuro, sarà importante per valutare il potenziale di altri sottoinsiemi progenitrici nel generare pDCs PP, in particolare se pDCs PP derivano da Flt3 + CLPS. Questa domanda è significativa in quanto non è chiaro il motivo per cui pDCs PP sono unicamente sensibili ai segnali IFNAR-STAT1 per PP accantonam.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. Alex Gelbard e Willem Overwijk consigli su trasferimento genico idrodinamica. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH (AI098099, SSW), l'MD Anderson Cancer Center for epigenetica, l'MD Anderson Center for infiammazione e cancro (SSW), e il Bob Smith Education Fund RE (HSL).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6. SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| Provette coniche da 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Provette coniche da 50 ml | BD Biosciences | 352070 | |
| Pinzette chirurgiche | |||
| Forbici sterili a coppia piccola Forbici | |||
| sterili a coppia grande | |||
| 40 μ filtro cellulare m | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μ provette con tappo per filtro cellulare m | BD Biosciences | 352235 | |
| tampone per lisi di globuli rossi | Sigma | R7757 | |
| tampone | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filtro sterilizzato | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenasi IV | Worthington LS004188 | ||
| Microsfere IgG anti-ratto di capra | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| colonna LD | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Ratto anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Ratto anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | ||
| Ratto anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 ( PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-SCA-1 (PE. Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC. Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Blu Pacifico) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC. Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE. Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Blu Pacifico) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Selezionatore cellulare | BD Biosciences, | ad es. BD Fortessa | |
| Lampada | |||
| Mouse retrattino | |||
| 1 ml Siringhe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ Aghi G (sterili) | Becton Dickinson | 305109 |
Riferimenti
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-prod....
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Ristampe e permessi
