Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц
Summary
Кровеносные сосуды в пределах скелетных мышц портовых нескольких мульти-клона населения предшественников человека, которые идеально подходят для восстановительных приложений. Этот метод изоляции позволяет одновременно очистку трех мультипотентными клеточных популяций предшественником соответственно из трех структурных слоев кровеносных сосудов: миогенные эндотелиальных клеток из интиме, Перициты от СМИ, и адвентициальные клеток от адвентиции.
Abstract
С момента открытия мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), уроженец идентичность и локализация МСК были затемняется ретроспективном изоляции в культуре. В последнее время, с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS), мы и другие исследователи определили перспективно и очищенный три субпопуляции мультипотентных клеток-предшественников, связанных с сосудистой скелетных мышц человека. Эти три популяции клеток: миогенные эндотелиальные клетки (МИК), Перициты (ПК), и адвентициальные клетки (ACS), локализованы соответственно к трем структурных слоев кровеносных сосудов: интима, СМИ и адвентиции. Все эти человеческого кровеносных сосудов стволовых клетки (hBVSC) населения не только выразить классические маркеры MSC, но и обладают мезодермальные потенциалы развития, аналогичные типичных МСК. Ранее СОВС, ПК, и кондиционеры были выделены через различные протоколы и впоследствии характеризуют в отдельных исследованиях. Нынешний прот изоляцияocol, посредством изменения процессе выделения и корректировок в селективных маркеров клеточной поверхности, позволяет нам одновременно очистить все три hBVSC субпопуляции от FACS из одного биопсии мышц человека. Этот новый метод будет не только оптимизировать изоляцию нескольких субпопуляций BVSC но и облегчить будущие клинического применения hBVSCs для различных терапевтических целей.
Introduction
Скелетных мышц человека была рассмотрена клинически привлекательным источником стволовых клеток / клеток-предшественников. Скелетных мышц содержит не только совершил миогенные предшественники, скелетные миобластов, но и примитивные миогенные стволовых клеток, в том числе спутниковых клеток и мышечных стволовых клеток (MDSCs) 1. Использование мышечных клеток, полученных человека стволовых / прогениторных, аутологичных или аллогенных, в регенеративной медицине широко исследованы в доклинических моделях животных и клинических испытаний. Регенеративные применения мышечных стволовых клеток / клеток-предшественников в диапазоне от регенерации дистрофические мышцы в мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) пациентов ремонтом травмированного сердце у пациентов с сердечным приступом.
С момента открытия мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК) и других мультипотентными клеточных популяций предшественника, в том числе мозга, полученных мультипотентными клеток костного взрослых предшественников (MAPCs) и полученные из жировой ткани стволовые клетки (ADSCs), взрослые стволовые /клетки-предшественники были широко изучены на сегодняшний день 1-9. Тем не менее, их родной идентичность и локализация на месте были затемняется ретроспективных методов изоляции. В последнее время с помощью сортировки флуоресценции активированных клеток (FACS), мы и другие группы перспективно определены и очищенные три мультипотентные клеточные популяции предшественника из кровеносных сосудов в пределах скелетных мышцах человека и ряда других органов: миогенные эндотелиальные клетки (МИК), перицитами (ПК), и адвентициальные клетки (кондиционеры) 10. Эти три субпопуляции человека кровеносных сосудов стволовых клеток (hBVSCs) может быть соответственно найти в трех структурных слоев кровеносных сосудов: внутренней оболочки, средняя оболочка, и туника адвентиции. Более конкретно, МИК и ПК обнаружены в микрососудов и капилляров в то время как кондиционеры локализованы в адвентиции слой больших артерий и вен. Каждая клетка-предшественник подмножество выражает уникальное сочетание антигенов клеточной поверхности: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), ПК (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), и КК (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
Дальнейшая характеристика этих hBVSC подмножеств показало, что все три популяции клеток предшественник обладают мезодермальные потенциалы развития, аналогичные типичных МСК, в том числе скелетной миогенеза, остеогенез, хондрогенеза и адипогенеза. Все подмножества hBVSC также демонстрируют классические маркеры MSC, в том числе CD44, CD73, CD90, CD105 и, недавно, и в культуре. В совокупности эти улики поддержал сосудистого происхождения МСК. Кроме того, терапевтические мощности MECs, ПК и КК недавно было продемонстрировано в отдельных исследованиях. MECs Начиная от взрослых биопсии человека мышечных были показаны для восстановления травмированных и дистрофические скелетных мышц и ремонта ранения миокарда более эффективно, чем скелетные миобластов и сосудов эндоthelial клетки (ECS). Очищенные ПК от различных органов человека, также было показано для ремонта / регенерации травмированных и дистрофические скелетных мышц и способствовать бассейна спутниковым клеток 13-16. Совсем недавно, мы продемонстрировали, что ПК, полученные из скелетных мышц человека эффективно восстанавливать инфаркта миокарда с помощью косвенных паракринного эффекта и прямых клеточных взаимодействий 17. ACS, с другой стороны, были либо непосредственно выделены из эксплантированных кровеносных сосудов или очищают с помощью FACS из жировой ткани человека и скелетных мышцах. Заметным проангиогенных эффект кондиционеров была продемонстрирована в мыши задних конечностей ишемии модели 19. Кроме того, кондиционеры, также было показано, чтобы восстановить инфаркта миокарда более эффективно, чем обычные МСК, что указывает на устойчивую терапевтический потенциал кондиционеров в ишемической восстановления тканей 20.
Нынешние гранты протокола очистки одновременные, проспективное очистка СОВС, ПК, иКК с сосудистой одного человека биопсии скелетных мышц. Это позволяет изучать и / или выбрать оптимальный hBVSC субпопуляции для различных терапевтических целей. Кроме того, эта новая техника расширяет репертуар стволовых клеток / клеток-предшественников, которые могут быть получены из скелетных мышц человека, что делает его идеальным источником мультипотентных клеток-предшественников для регенеративной медицины.
Protocol
Representative Results
Discussion
Идентификация и очистка hBVSC субпопуляций представляют собой важный шаг вперед в постижении MSC онтогенеза. Существует все больше свидетельств, указывающих на периваскулярное происхождение МСК и связь между тканеспецифических клеток-предшественников и кровеносных сосудов 22-25. К?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Элисон Логар за отличную техническую помощь с проточной цитометрии. Эта работа была поддержана грантами от Министерства обороны (JH), Генри Дж Манкин Обладая кафедры (JH) и Министерства образования и науки Республики Казахстан (AS). КХО была частично поддержана со стороны predoctoral общении Американской ассоциации сердца (11PRE7490001). M.Corselli при поддержке Калифорнийского института регенеративной медицины учебного гранта (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
