Isolering af blod-fartøj-afledt Multipotente Forstadier fra human skeletmuskel
Summary
Blodkar inden for human skeletmuskulatur havnen flere multi-slægt precursor-populationer, der er ideelle til regenerativ applikationer. Denne isolation metode tillader samtidig oprensning af tre multipotente forstadie cellepopulationer fra henholdsvis tre strukturelle lag af blodkar: myogene endotelceller fra intima, pericytter fra medier og adventitiaceller celler fra adventitia.
Abstract
Siden opdagelsen af mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC), har den indfødte identitet og lokalisering af MSC'er blevet tilsløret af deres retrospektiv isolation i kultur. For nylig, ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS), vi og andre forskere prospektivt identificeret og renset tre subpopulationer af multipotente precursorceller associeret med vaskulaturen af human skeletmuskel. Disse tre cellepopulationer: myogene endotelceller (MECS), pericytter (pc'er), og adventitiaceller celler (ACS), er lokaliseret på henholdsvis de tre strukturelle lag af blodkar: intima, medier og adventitia. Alle disse humant blod-fartøj-afledt stamceller (hBVSC) befolkningsgrupper ikke kun udtrykke klassiske MSC markører, men også besidder mesodermale udviklingsmæssige potentialer ligner typiske MSC. Tidligere har MECS, pc'er og ACS blevet isoleret gennem særskilte protokoller og efterfølgende kendetegnet ved separate undersøgelser. Den nuværende isolation protocol gennem ændringer af isolation proces og tilpasninger i den selektive celleoverflademarkører, giver os mulighed for samtidig at rense alle tre hBVSC subpopulationer ved FACS fra en enkelt menneskelig muskel biopsi. Denne nye metode vil ikke kun strømline isolering af flere BVSC subpopulationer men også lette fremtidige kliniske anvendelser af hBVSCs til forskellige terapeutiske formål.
Introduction
Human skeletmuskel er blevet betragtet som en klinisk attraktiv kilde til stamceller / progenitorceller. Skeletmuskel indeholder ikke kun begået myogene stamceller, skelet myoblaster, men også primitive myogene stamceller, herunder satellit celler og muskler-afledte stamceller (MDSCs) 1. Eventuel brug af menneskelige muskel-afledte stamceller / progenitorceller, autolog eller allogen, i regenerativ medicin er blevet grundigt undersøgt i prækliniske dyremodeller og kliniske forsøg. De regenerative anvendelser af muskel stamceller / progenitorceller spænder fra regenerering af dystrofisk muskel i Duchennes muskeldystrofi (DMD) patienter til at reparere den skadede hjertet hos patienter med hjerteanfald.
Siden opdagelsen af mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC) og andre multipotente forløber cellepopulationer, herunder knoglemarv-afledte multipotente voksne stamceller (mapcs) og adipøst afledte stamceller (ADSCs), voksne stamceller /progenitorceller er blevet grundigt undersøgt til dato 1-9. Ikke desto mindre har deres oprindelige identitet og lokalisering i stedet blevet tilsløret af de retrospektive isolation metoder. For nylig, ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS), vi og andre grupper har prospektivt identificeret og renset tre multipotente forløber cellepopulationer fra blodkar i human skeletmuskel og flere andre organer: myogene endotelceller (MEC'er), pericytter (pc'er), og adventitiaceller celler (ACS) 10. Disse tre subpopulationer af humant blod-fartøj-afledte stamceller (hBVSCs) kan henholdsvis findes i de tre strukturelle lag af blodkar: tunica intima, tunica media og tunica adventitia. Mere specifikt MEC'er og pc'er detekteres i mikrokar og kapillærer, mens ACS er lokaliseret i adventitia lag af større arterier og vener. Hvert precursor celledelmængde udtrykker en unik kombination af celleoverfladeantigener: MEC'er (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), pc'er (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), og ACs (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
Yderligere karakterisering af disse hBVSC undergrupper viste, at alle tre forstadium cellepopulationer besidder mesodermale udviklingsmæssige potentialer ligner typiske MSC'er, herunder skelet myogenese, osteogenese, chondrogenese og adipogenese. Alle hBVSC undergrupper udviser også klassiske MSC markører, herunder CD44, CD73, CD90 og CD105, frisk og i kultur. Kollektivt disse beviser støttede vaskulær oprindelse MSC. Desuden har de terapeutiske kapacitet MEC'er, pc'er og ACS nylig blevet påvist i separate undersøgelser. MEC'er sorteret fra voksne humane muskelbiopsier viste sig at regenerere sårede og dystrofiske skelet muskler og reparere såret myocardium mere effektivt end skelet myoblaster og vaskulær endothelial celler (ECS). Rensede pc'er fra forskellige menneskelige organer har også vist sig at reparere / regenerere sårede og dystrofiske skeletmusklerne og bidrage til satellit cellepool 13-16. For nylig har vi vist, at pc'er, der stammer fra human skeletmuskel effektivt reparere infarcted myocardium gennem indirekte paracrin effekt og direkte cellulære vekselvirkninger 17. ACS, på den anden side, har været enten direkte isoleret fra eksplanterede blodkar eller oprenses ved FACS fra human fedtvæv og skeletmuskulatur. En bemærkelsesværdig pro-angiogene effekt af ACs blev påvist i en mus hind-lemmer iskæmi-model 19. Desuden har ACs også vist sig at reparere infarkterede myocardium mere effektivt end konventionelle MSC'er, hvilket indikerer den robuste terapeutiske potentiale ACs i væv iskæmisk reparation 20.
De nuværende oprensningsprotokol tilskud samtidige, prospektivt rensning af Mecs, pc'er ogACs fra vaskulaturen af et enkelt humant skeletmuskelbiopsi. Dette giver os mulighed for at studere og / eller vælge den optimale hBVSC delpopulation til forskellige terapeutiske formål. Desuden er denne nye teknik yderligere udvider repertoiret af stamceller / stamceller, der kan udledes fra human skeletmuskel, hvilket gør det til et ideelt kilde multipotente præcursorceller til regenerativ medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifikation og oprensning af hBVSC subpopulationer udgør et stort fremskridt i forståelsen af MSC ontogeni. Der er stigende tegn angiver perivaskulær oprindelse MSC og associationen mellem vævsspecifikke prækursorceller og blodkar 22-25. Hertil kommer, at den kapacitet isolere homogene delpopulationer af hBVSCs yderligere stoette forståelsen af MSC heterogenitet og vaskulær cellebiologi 26.
I de sidste par år har MEC'er, pc'er og ACS blevet indi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at takke Alison Logar for hendes fremragende teknisk bistand med flowcytometri. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Department of Defense (JH), Henry J. Mankin Begavet Chair (JH), og Ministeriet for uddannelse og videnskab i Republikken Kasakhstan (AS). CWC blev delvist understøttet af American Heart Association predoctoral fællesskab (11PRE7490001). M.Corselli blev støttet af California Institute til regenerativ medicin uddannelse tilskud (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
