मानव कंकाल की मांसपेशी से रक्त वाहिका व्युत्पन्न multipotent व्यापारियों का अलगाव
Summary
पुनर्योजी अनुप्रयोगों के लिए आदर्श होते हैं कि मानव कंकाल की मांसपेशी बंदरगाह कई बहु वंश अग्रदूत आबादी के भीतर रक्त वाहिकाओं. Intima से myogenic endothelial कोशिकाओं, मीडिया से pericytes, और बाह्यकंचुक से adventitial कोशिकाओं: इस अलगाव विधि रक्त वाहिकाओं के तीन संरचनात्मक परतों से क्रमश: तीन multipotent अग्रदूत सेल आबादी का एक साथ शुद्धि की अनुमति देता है.
Abstract
Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCS) की खोज के बाद से, देशी पहचान और MSCs का स्थानीयकरण संस्कृति में उनके पूर्वव्यापी अलगाव से छिप गया है. हाल ही में, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करते हुए, हम और अन्य शोधकर्ताओं ने भावी मानव कंकाल की मांसपेशी की वाहिका संरचना के साथ जुड़े multipotent अग्रदूत साबित कोशिकाओं के तीन subpopulations पहचान और शुद्ध. इन तीन सेल आबादी: intima, मीडिया, और बाह्यकंचुक: myogenic endothelial कोशिकाओं (MECS), pericytes (पीसी), और adventitial कोशिकाओं (एसी), रक्त वाहिकाओं के तीन संरचनात्मक परतों को क्रमश स्थानीयकृत हैं. इन मानव रक्त वाहिका व्युत्पन्न स्टेम सेल (hBVSC) के सभी क्लासिक एमएससी मार्करों व्यक्त लेकिन यह भी ठेठ MSCs के समान mesodermal विकास क्षमता के अधिकारी आबादी न केवल. इससे पहले, MECS, पीसी, और एसी अलग प्रोटोकॉल के माध्यम से पृथक किया गया है और बाद में अलग अध्ययनों में होती है. वर्तमान अलगाव protocol, चयनात्मक कोशिका की सतह मार्कर में अलगाव की प्रक्रिया में संशोधन और समायोजन के माध्यम से, हमें एक साथ एक ही मानव मांसपेशी बायोप्सी से FACS द्वारा सभी तीन hBVSC subpopulations शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है. इस नई विधि केवल कई बी.वी.एससी subpopulations के अलगाव को कारगर बनाने, लेकिन यह भी विशिष्ट चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए hBVSCs के भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों की सुविधा नहीं होगी.
Introduction
मानव कंकाल की मांसपेशी स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की एक चिकित्सकीय आकर्षक स्रोत माना गया है. कंकाल की मांसपेशी केवल उपग्रह कोशिकाओं और मांसपेशियों व्युत्पन्न स्टेम सेल (MDSCs) 1 सहित myogenic progenitors, कंकाल myoblasts, लेकिन यह भी आदिम myogenic स्टेम सेल, प्रतिबद्ध नहीं होता है. पुनर्योजी चिकित्सा में मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, ऑटोलॉगस या allogeneic, का उपयोग बड़े पैमाने पर पूर्व नैदानिक पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों में जांच की गई है. मांसपेशी स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के पुनर्योजी अनुप्रयोगों दिल का दौरा पड़ने के साथ रोगियों में घायल दिल की मरम्मत करने के लिए Duchenne पेशी dystrophy (डीएमडी) के रोगियों में dystrophic मांसपेशी regenerating से लेकर.
अस्थि मज्जा व्युत्पन्न multipotent वयस्क पूर्वज कोशिकाओं (MAPCs) और वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ADSCs), वयस्क स्टेम / सहित mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCS) और अन्य multipotent अग्रदूत सेल आबादी, की खोज के बाद सेपूर्वज कोशिकाओं बड़े पैमाने पर तिथि 1-9 करने के लिए जांच की गई है. फिर भी, बगल में उनके मूल पहचान और स्थानीयकरण पूर्वव्यापी अलगाव तरीकों से छिप गया है. हाल ही में, छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) का उपयोग करते हुए, हम और अन्य समूहों भावी पहचान की है और रक्त मानव कंकाल की मांसपेशी के भीतर जहाजों और कई अन्य अंगों से शुद्ध तीन multipotent अग्रदूत सेल आबादी: myogenic endothelial कोशिकाओं (MECS), pericytes (पीसी), और adventitial कोशिकाओं (एसी) 10. Tunica intima, Tunica मीडिया, और Tunica बाह्यकंचुक: मानव रक्त वाहिका व्युत्पन्न स्टेम सेल (hBVSCs) के इन तीन subpopulations क्रमशः रक्त वाहिकाओं के तीन संरचनात्मक परतों में पाया जा सकता है. एसी बड़ा धमनियों और नसों की बाह्यकंचुक परत में स्थानीयकृत हैं, जबकि अधिक विशेष रूप से, MECS और पीसी microvessels और केशिकाओं में पता चला रहे हैं. (सी MECS: प्रत्येक अग्रदूत सेल सबसेट कोशिका की सतह प्रतिजनों की एक अद्वितीय संयोजन व्यक्तD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), पीसी (CD146 + / 34 – / 45 – 56 / -), और एसी (CD34 + / 31 – / 45 – / – 56/146 -).
इन hBVSC कैंपेन्स के आगे लक्षण वर्णन सभी तीन अग्रदूत सेल आबादी कंकाल myogenesis, अस्थिजनन, उपास्थिजनन, और adipogenesis सहित ठेठ MSCs के समान mesodermal विकास क्षमता के अधिकारी का पता चला. सभी hBVSC कैंपेन्स भी CD44, CD73, CD90, और CD105, हौसले और संस्कृति में शामिल क्लासिक एमएससी मार्कर, दिखा रहे हैं. सामूहिक रूप से सबूत के इन टुकड़ों MSCs की नाड़ी मूल का समर्थन किया. इसके अलावा, MECS, पीसी, और एसी की चिकित्सीय क्षमता हाल ही में अलग अध्ययनों में प्रदर्शन किया गया है. वयस्क मानव मांसपेशी बायोप्सी से क्रमबद्ध MECS घायल हो गए और dystrophic कंकाल की मांसपेशियों और मरम्मत घायल मायोकार्डियम अधिक कुशलता से कंकाल myoblasts और नाड़ी एंडो पुनर्जीवित करने के लिए दिखाया गयाthelial कोशिकाओं (ईसीएस). विभिन्न मानव अंगों से शुद्ध पीसी भी / मरम्मत घायल हो गए और dystrophic कंकाल की मांसपेशियों को पुनर्जीवित और उपग्रह सेल पूल 13-16 में योगदान करने के लिए दिखाया गया है. हाल ही में, हम मानव कंकाल की मांसपेशी से व्युत्पन्न पीसी प्रभावी ढंग से अप्रत्यक्ष पैराक्राइन प्रभाव और प्रत्यक्ष सेलुलर बातचीत के माध्यम से 17 infarcted मायोकार्डियम में सुधार दिखा दिया है कि. एसी, दूसरे हाथ पर, या तो कर दिया गया है सीधे explanted रक्त वाहिकाओं से अलग या मानव वसा ऊतकों और कंकाल की मांसपेशी से FACS द्वारा शुद्ध. एसी की एक उल्लेखनीय समर्थक वाहिकाजनक प्रभाव एक माउस हिंद अंग ischemia मॉडल 19 में प्रदर्शन किया गया. इसके अलावा, एसी भी इस्कीमिक ऊतकों की मरम्मत 20 में एसी की मजबूत चिकित्सीय क्षमता का संकेत है, और अधिक कुशलता से पारंपरिक MSCs से infarcted मायोकार्डियम में सुधार करने के लिए दिखाया गया है.
एक साथ वर्तमान शुद्धि प्रोटोकॉल अनुदान, MECS, पीसी के भावी शुद्धि, औरएक भी मानव कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी की वाहिका संरचना से एसी. यह हमारे अध्ययन और / या विशिष्ट चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए इष्टतम hBVSC subpopulation चुनने के लिए अनुमति देता है. साथ ही, यह नई तकनीक भविष्य में इसे और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए multipotent अग्रदूत साबित कोशिकाओं का एक आदर्श स्रोत है, जिससे मानव कंकाल की मांसपेशी से प्राप्त किया जा सकता है कि स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार.
Protocol
Representative Results
Discussion
HBVSC subpopulations की पहचान और शुद्धि एमएससी व्यक्तिवृत्त की समझ में एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्व करते हैं. MSCs की परिवाहकीय मूल और ऊतक विशेष अग्रदूत साबित कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं 22-25 के बीच सहयोग का संक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों फ्लो के साथ उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एलिसन लोगार का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के रक्षा विभाग (झा), हेनरी जे Mankin संपन्न चेयर (झा), और शिक्षा और कजाखस्तान गणराज्य के विज्ञान मंत्रालय (एएस) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. सीडब्ल्यूसी अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन predoctoral फैलोशिप (11PRE7490001) द्वारा समर्थित किया गया था. M.Corselli पुनर्योजी चिकित्सा प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (TG2-01169) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
