Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle
Summary
Blodkärl inom mänskliga skelettmuskulaturen hamnen flera flera härstamning prekursor befolkningsgrupper som är idealiska för regenerativa applikationer. Denna isoleringsmetoden möjliggör samtidig rening av tre multi prekursor cellpopulationer respektive från tre strukturella lager av blodkärl: myogena endotelceller från intima, pericyter från media och adventitiala celler från adventitia.
Abstract
Sedan upptäckten av mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC), har det ursprungliga identitet och lokalisering av MSC fördunklats av sin retrospektiv isolering i kultur. Nyligen, med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), vi och andra forskare prospektivt identifieras och renas tre subpopulationer av multipotenta prekursorceller som är förknippade med kärlsystemet i human skelettmuskel. Dessa tre cellpopulationer: myogena endotelceller (MEC), pericyter (PC) och adventitiala celler (ACS), är lokaliserade till de respektive tre strukturella lager av blodkärl: intima, media och adventitia. Alla dessa blodkärlet härrörande stamcells människa (hBVSC) populationer inte bara uttrycka klassiska MSC markörer, utan också besitter mesodermala utvecklingspotentialer som liknar typiska MSC. Tidigare har MECs, datorer och ACs isolerats genom olika protokoll och därefter karakteriseras i separata studier. Den nuvarande isolering protocol, genom ändringar av isoleringsprocessen och justeringar i de selektiva cellytmarkörer, ger oss möjlighet att samtidigt rena alla tre hBVSC subpopulationer av FACS från en enda människa muskelbiopsi. Denna nya metod kommer inte bara att effektivisera isoleringen av flera BVSc subpopulationer, men också underlätta framtida kliniska tillämpningar av hBVSCs för olika terapeutiska syften.
Introduction
Mänsklig skelettmuskel har ansetts vara en kliniskt attraktiv källa för stam / progenitorceller. Skelettmuskulatur innehåller inte bara begått myogena progenitorceller, skelett myoblaster, men också primitiva myogena stamceller, inklusive satellitceller och muskel-härledda stamceller (MDSCs) 1. Användningen av mänskliga muskel härrörande stam / progenitorceller, autolog eller allogen, i regenerativ medicin har undersökts i prekliniska djurmodeller och kliniska prövningar. De regenerativa tillämpningar av muskel stam / progenitorceller allt från regenerering av dystrofisk muskeln i Duchennes muskeldystrofi (DMD) patienter att reparera skadade hjärtan hos patienter med hjärtinfarkt.
Sedan upptäckten av mesenkyma stamceller / stromaceller (MSC) och andra multipotenta prekursor cellpopulationer, inklusive benmärgshärledda multipotenta vuxen progenitorceller (MAPCs) och adipos-härledda stamceller (ADSCs), adulta stamceller /progenitorceller har undersökts hittills 1-9. Ändå har deras ursprungliga identitet och lokalisering på plats varit skyms av de retroaktiva isoleringsmetoder. Nyligen, med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), vi och andra grupper har prospektivt identifierade och renade tre multigångare cellpopulationer från blodkärl i human skelettmuskel och flera andra organ: myogena endotelceller (MEC), pericyter (PC), och adventitiala celler (ACS) 10. Dessa tre subpopulationer av mänskliga blodkärls-härledda stamceller (hBVSCs) kan respektive finns i de tre strukturella lager av blodkärl: tunica intima, tunica media och tunica adventitia. Mer specifikt MECs och datorer upptäcks i mikrokärl och kapillärer medan ACS är lokaliserade i adventitia lager av större artärer och vener. Varje prekursorcell delmängd uttrycker en unik kombination av cellytantigener: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), datorer (CD146 + / 34 – / 45 – / 56 -), och ACs (CD34 + / 31 – / 45 – / 56 – / 146 -).
Ytterligare karakterisering av dessa hBVSC undergrupper visade att alla tre föregångare cellpopulationer har mesodermala utvecklingspotentialer som liknar typiska MSC, inklusive skelett myogenes, osteogenesis, kondrogenes och adipogenes. Alla hBVSC delmängder uppvisar också klassiska MSC markörer, inklusive CD44, CD73, CD90 och CD105, nyligen och i kultur. Kollektivt dessa bevis stödde den vaskulära ursprung MSC. Dessutom har de terapeutiska kapacitet MECs, datorer och ACs nyligen visats i separata studier. MECs sorterade från vuxna humana muskelbiopsier visades att regenerera skadade och dystrofa skelettmuskler och reparationer skadade hjärtmuskeln mer effektivt än skelett myoblasts och vaskulär endothelial celler (ECS). Renade datorer från olika mänskliga organ har också visat att reparera / regenerera skadade och dystrofa muskler och bidrar till satellitcellpoolen 13-16. Helt nyligen har vi visat att datorer som härrör från humant skelettmuskel effektivt reparera infarkthjärtmuskeln genom indirekta parakrin effekt och direkta cellulära interaktioner 17. ACs, å andra sidan, har varit antingen direkt isoleras från explanterade blodkärl eller renas genom FACS från human fettvävnad och skelettmuskulatur. Ett anmärkningsvärt pro-angiogena effekten av ACs visades i en mus hind-ischemi modell 19. Dessutom har ACs också visat att reparera infarkthjärtmuskeln mer effektivt än konventionella MSC, vilket indikerar den robusta terapeutiska potentialen hos ACS i ischemisk vävnad reparera 20.
De nuvarande reningsprotokollbidrag samtidiga, blivande rening av mecs, datorer ochACs från vaskulaturen av en enda human skelettmuskelbiopsi. Detta ger oss möjlighet att studera och / eller välja den optimala hBVSC subpopulation för olika terapeutiska syften. Dessutom den nya tekniken expanderar ytterligare repertoaren av stam / progenitorceller som kan härledas från human skelettmuskel, vilket gör den till en idealisk källa för multi prekursorceller för regenerativ medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifiering och rening av hBVSC subpopulationer representerar ett stort framsteg i förståelsen av MSC ontogeni. Det finns allt fler bevis indikerar perivaskulär ursprung MSC och föreningen mellan vävnadsspecifika prekursorceller och blodkärl 22-25. Dessutom, förmågan att isolera homogena subpopulationer av hBVSCs aids förståelsen av MSC heterogenitet och vaskulär cellbiologi 26 ytterligare.
Under de senaste åren har MECs, datorer och ACs individuellt ident…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Alison Logar för hennes utmärkta tekniskt bistånd med flödescytometri. Detta arbete har finansierats med bidrag från Department of Defense (JH), Henry J. Mankin Begåvad ordförande (JH), och ministeriet för utbildning och vetenskap i Republiken Kazakstan (AS). CWC stöddes delvis av American Heart Association Predoctoral gemenskap (11PRE7490001). M.Corselli stöddes av California Institute för regenerativ medicin utbildningsbidrag (TG2-01169).
Materials
| Collagenase Type 1 | Sigma | C5894 | Sterile vial |
| Collagenase Type 2 | Sigma | C1764 | Sterile vial |
| Collagenase Type 4 | Sigma | C1889 | Sterile vial |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Keep sterile |
| Anti-human CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| Anti-human CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| Anti-human CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Keep sterile |
| Anti-human CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Keep sterile |
| FACSAria II Flow Cytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Complete Medium | Lonza | CC-3162 | For culturing PCs (only P0) |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965 | For culturing PCs |
| DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate | Invitrogen | 11995 | For culturing MECs and ACs |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Chick embryo extract | Accurate Chemical | CE650T-10 | Filter before use |
References
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Zimmerlin, L., et al. Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue. Cytometry. 77, 22-30 (2010).
- Reyes, M., et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. The Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346 (2002).
- Choi, Y., Ta, M., Atouf, F., Lumelsky, N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells. 22, 1070-1084 (2004).
- Zengin, E., et al. Vascular wall resident progenitor cells: a source for postnatal vasculogenesis. Development. 133, 1543-1551 (2006).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109 (2010).
- Ballas, C. B., Zielske, S. P., Gerson, S. L. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: Implications for greater use. Journal of Cellular Biochemistry. 85, 20-28 (2002).
- Chen, C. -. W., Corselli, M., Péault, B., Huard, J. Human Blood-Vessel-Derived Stem Cells for Tissue Repair and Regeneration. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 597439 (2012).
- Zheng, B., et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotech. 25, 1025-1034 (2007).
- Okada, M., et al. Myogenic Endothelial Cells Purified From Human Skeletal Muscle Improve Cardiac Function After Transplantation Into Infarcted Myocardium. Journal of the American College of Cardiology. 52, 1869-1880 (2008).
- Crisan, M., et al. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Park, T. S., et al. Placental Perivascular Cells for Human Muscle Regeneration. Stem Cells and Development. 20, 451-463 (2011).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Chen, C. -. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. STEM CELLS. 31 (2), 305-316 (2012).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 21, 1299-1308 (2012).
- Campagnolo, P., et al. Human Adult Vena Saphena Contains Perivascular Progenitor Cells Endowed With Clonogenic and Proangiogenic Potential. Circulation. 121, 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of Human Pericyte Progenitor Cells Improves the Repair of Infarcted Heart Through Activation of an Angiogenic Program Involving Micro-RNA-132 / Novelty and Significance. Circulation Research. 109, 894-906 (2011).
- Zheng, B., et al. Human myogenic endothelial cells exhibit chondrogenic and osteogenic potentials at the clonal level. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1089-1095 (2013).
- Caplan, A. I. All MSCs Are Pericytes. Cell Stem Cell. 3, 229-230 (2008).
- Feng, J., Mantesso, A., Sharpe, P. T. Perivascular cells as mesenchymal stem cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 1441-1451 (2010).
- Tang, W., et al. White Fat Progenitor Cells Reside in the Adipose Vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Krautler, N. J., et al. Follicular Dendritic Cells Emerge from Ubiquitous Perivascular Precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry.113. 113, 2806-2812 (2012).
- Chen, C. -. W., et al. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: Regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20, 429-434 (2009).
- Lin, C. -. S., Lue, T. F. Defining Vascular Stem Cells. Stem Cells Dev. 22, 1018-1026 (2013).
- Tang, Z., et al. Differentiation of multipotent vascular stem cells contributes to vascular diseases. Nat Commun. 3, 875 (2012).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21, 1087-1093 (2012).
