Fagositik hücreler kaldırma ve phagosomes istila mikroorganizmaları ortadan kaldırarak, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde önemli bir rol oynamaktadır. Fagosom olgunlaşma olgunlaşmamış bir fagosom sitoplazmada çeşitli hücresel organellere ve bölmeleri ile iyi yönetilen bir etkileşimler yoluyla köklü dönüşüme uğrar sırasında karmaşık ve sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Onların litik ve bakterisidal özellikleri ile phagosomes donatarak fagositik hücrelerin fizyolojik fonksiyonu için gerekli olan bu süreç, lizozomlar ve phagosomes için olgunlaşma son ve kritik aşama olarak kabul edilir fagolizozomları arasında biyotekvinin ile phagosomes füzyonu sona eriyor. Bu raporda, biz phagolysosome biyotekvinin bir özelliğidir içerik dağıtım, fagosom için lizozoma dinamik süreci kalitatif ve kantitatif analiz için canlı hücre görüntüleme bazlı yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, phagocy için bir model olarak IgG kaplı mikro-boncuklar kullanırbir lizozomal luminal yük prob olarak apoptosisi ve fluorofor ile konjüge edilmiş dekstran molekülleri, zaman atlamalı görüntüleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak canlı makrofajlarda gerçek zamanlı olarak phagosomes için lysosmal dinamik içerik teslim takip etmek amacıyla. Burada ayrıntılı olarak arka plan, hazırlık aşamaları ve diğer laboratuvarlar bu yöntemin kolay ve hassas bir dağıtım sağlamak için adım adım bir deney düzeneği tarif. Bizim tanımlanan metot basit, sağlam, ve en önemlisi, kolayca farklı sistemlerde ve örneğin çeşitli fagositik hücreler türleri, kayıp-fonksiyon deneyleri, farklı prob kullanımı gibi çeşitli deneysel ayarları altında phagosomal etkileşimleri ve olgunlaşmasını çalışmak için adapte edilebilir, ve Fagositik parçacıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis'den Çalışması
Bu makalede
Özet
Giriş
Makrofajlar dahil olmak üzere, profesyonel fagositlerin, bağışıklık sisteminde önemli bir oyun. Doğuştan gelen bağışıklık sistemindeki ilk savunma hattı olmasının yanı sıra, aynı zamanda bir rol 1-3 sunulması da sinyalizasyon ve antijen ile edinilmiş bağışıklık aktivasyonunda kritik bir rol oynamaktadır. Profesyonel fagositlerin işlevi çok yönlü iken, fagosom olgunlaşma profesyonel fagositlerin 4,5 bakterisit ve antijen işleme fonksiyonlarının kritik bir omurgadır. Reseptör aracılı yutulma ve bakteriler gibi bir fagositik hedef, alımından sonra, olgunlaşmamış fagosom etkileşim ve endositik ağ bölümlerinde ve çeşitli diğer hücresel organel 6....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde, hayvan bakımı ve bütün prosedürler, kurumsal ve ulusal kurallara uyun.
"Π-" önceden ile gösterilir hazırlıkları hazırlayın.
1.. BMMs hazırlanması
- Servikal dislokasyon ile farelerin itlafı yapın.
- Doku femur ve tibia kemikleri, ücretsiz kemikleri çıkarın ve kemik iliği erişilebilirlik için iki ucunu kesin.
- Buz soğukluğunda PBS veya bir sonraki safhaya kadar buz üzerinde 100 ug / ml streptomisin ve 100 U / ml penisilin ve ile desteklenmiş buz soğukluğunda DMEM ortamında (in kemik tutun.
Not: kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir sınıf ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Görüntüleme için hücrelerin ve boncukların doğru hazırlama kritik önem taşır. Şekil 1 BMMs için Optimize edilen protokolüne bağlı olarak tohumlama, prob yükleme ve bu yöntemde ilk görüntüleme adımlar, ana hatlarını göstermektedir. Bu protokol parametreleri hücreleri ve kullanılacak olan sondaların türüne bağlı olarak test edilmiş ve optimize edilmesi bu nedenle önemlidir.
Önceden yüklenmiş hücrelere IgG kaplı boncuk ilave edildikten sonra, bu büyütme önceden tanımlanmış ayar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Aşağıdaki bölümde sunulan yöntem ve sınırlamalar kritik adımları görüşecek. Ayrıca, biz, onların çözümleri ile yaygın sorunlardan bazıları bağlamak olası değişiklikler tanıtmak ve bizim yöntemin avantajları yanı sıra, bu yaklaşıma uygun tamamlayıcı yöntemler dikkate alacaktır.
Boncuk yüzeye IgG bağlanması da dahil olmak üzere boncuklar, preparasyonu, önemlidir ve unfresh preparasyonlar kullanımından kaçınılmalıdır. Buna ilave olarak, dekstran taze her deney öncesi donmuş stok (seyreltilmiş v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz yazının eleştirel okuma için fagosom Biyoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma, bir Helmholtz Genç Araştırmacı hibe (Girişimi ve Helmholtz Derneği Ağ fonları) ve Öncelikli Programı Alman Araştırma Konseyi (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) içinde SPP1580 Grant tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamı (D-MEM) | PAA, Avusturya | E15-009 | |
| Dulbecco'nun fenol kırmızısı içermeyen Modifiye Kartallar Ortamı (D-MEM) | PAA, Avusturya | E15-047 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | PAA, Avusturya | A15-151 | |
| L-Glutamin | PAA, Avusturya | M11-004 | |
| PBS | PAA, Avusturya | H15-002 | |
| Penisilin / Streptomisin | PAA, Avusturya | P11-010 | |
| WillCo-dish® Cam alt çanak (35 mm & boş;, # 1.5) | WillCo Wells, Hollanda | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM cam alt çanak, 35 mm | Greiner Bio one, Almanya | 627871 | Alternatif: Segmentli |
| Karboksilatlı lateks mikrokürecikler | Polysciences, USA | #09850 | Farklı çaplarda mevcuttur, 3 &mu kullandık; m |
| Polistiren mikropartiküller | Kisker Biotech, Almanya | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Almanya | 305.1.3 | |
| fare bütün IgG | Rockland, ABD | 010-0102 | |
| EDAC çapraz bağlayıcı | Sigma-Aldrich, ABD | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich, ABD | T1503 | |
| 1 ml şırınga Omnifix -F | B.Braun, Almanya | 9161406V | |
| 26 G iğnesi (0.45 * 25 mm) | B.Baun, Almanya | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Avusturya | E15-039 | |
| At Serumu | Gibco, ABD | 16050-122 | |
| MES hidrat | Sigma-Aldrich, ABD | M2933 | |
| 0.2 & mu; M şırıngaya monte filtre | Sartorius, Almanya | 83.1826.001 |
Kaynaklar
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
