Summary
على عكس خالية من الخلايا HIV-1 الجسيمات، ومست الخلايا المصابة CD4 + T بشكل فعال من قبل الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (pDCs). تصف هذه المخطوطة طريقة حيث الخلايا الطرفية الدم وحيدات النوى (PBMCs) أو pDCs معزولة هي شارك في تربيتها مع HIV-1 خلايا T المصابة لتقييم الاستشعار الفطرية التي pDCs والمقررة من قبل الافراج عن النوع الأول IFN.
Abstract
HIV-1 الاستشعار الفطري يتطلب اتصال مباشر من الخلايا المصابة CD4 + T مع الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (pDCs). من أجل دراسة هذه العملية، والبروتوكولات المذكورة هنا تستخدم الخلايا المعزولة حديثا الإنسان الطرفية الدم وحيدات النوى (PBMCs) أو الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل (pDCs) لاستشعار التهابات في إما T خط الخلية (MT4) أو خلايا CD4 + T الابتدائية مغاير. من أجل ضمان الاستشعار السليم، فمن الضروري أن PBMC معزولة مباشرة بعد جمع الدم وهذه النسبة المثلى للخلايا T المصابة يتم استخدامها. وعلاوة على ذلك، متعددة حدودي تدفق cytometric تلطيخ يمكن استخدامها للتأكد من أن عينات PBMC تحتوي على الأنساب مختلفة من الخلايا في نسب الفسيولوجية. ويمكن أيضا أن يدرج عدد من الضوابط لتقييم الجدوى وظائف pDCs. وتشمل هذه، فإن وجود علامات سطح معينة، وتقييم الاستجابات الخلوية إلى ناهض المعروفة تول-مثل مستقبلات (TLR) مسارات، ويؤكد عدم وجود المقدمينtaneous النوع الأول مضاد للفيروسات (IFN) الإنتاج. في هذا النظام، PBMCs طازجة معزولة أو pDCs هي شارك في تربيتها مع HIV-1 الخلايا المصابة في 96 لوحات جيدا ل18-22 ساعة. ثم يتم استخدام Supernatants من هذه الثقافات المشتركة لتحديد مستويات النشطة بيولوجيا الإنتيرفيرون النوع الأول من خلال رصد تفعيل المسار ISGF3 في كلوة الأزرق IFN-α خلايا / β. قبل وأثناء ظروف ثقافة مشتركة، الخلايا المستهدفة يمكن أن تخضع لتحليل تدفق cytometric لتحديد عدد من المعلمات، بما في ذلك النسبة المئوية للخلايا المصابة، ومستويات علامات سطح معينة، وقتل الفرق من الخلايا المصابة. وعلى الرغم من هذه البروتوكولات وضعت في البداية لمتابعة إنتاج نوع-I IFN، وأنها يمكن أن تستخدم لدراسة الجزيئات الأخرى imuno-تغييري صدر من pDCs واكتساب مزيد من التبصر في الآليات الجزيئية التي تنظم HIV-1 الاستشعار الفطري.
Introduction
اكتب-I IFN المنتجة للpDCs تمثل خط الدفاع الأول ضد العدوى الفيروسية، وعلى هذا النحو يكون بمثابة حلقة وصل حيوية بين الفطرية والتكيفية الحصانة 1. بينما خالية من الخلايا HIV-1 جسيمات يتم الكشف سيئة من قبل النظام المناعي الفطري، ومست المصابة HIV-1 خلايا CD4 + T بشكل فعال من قبل pDCs 2. آلية الاستشعار تتطلب الاتصال الأولي بين بروتين سكري المغلف الفيروسي (gp120) في سطح T الخلية المصابة وجزيئات CD4 على PDC، الذي هو ثم تليها التقاط الفيروس واستيعاب من قبل الحزب الديمقراطي المسيحي. الاعتراف اللاحق لنقل HIV-1 الحمض النووي الريبي TLR7 يؤدي تفعيل Myd88 / IRF7 الطريق ويؤدي في النهاية إلى كتابة-I الإنتاج IFN 3. الأهم من ذلك أن مسار الاستشعار الثاني الحالي في pDCs التي بوساطة TLR9، وتحول دون تفاعل بروتين سكري الفيروسي، gp120، مع PDC محددة علامة السطح BDCA2 4.
> ومسارات TLR7 وTLR9 الاستشعار من الحزب الديمقراطي المسيحي يحتمل أن يكون منظم سلبا إشراك BST2 (المسمى أيضا Tetherin أو CD317) مع PDC محددة مستقبلات المثبطة سطح آخر يسمى ILT7 5. وأعرب عن BST2 عند مستويات مرتفعة على سطح pDCs وبعض الخلايا السرطانية، ولكن على مستويات أقل نسبيا في أنواع الخلايا الأخرى، مثل خلايا B، الضامة، والخلايا T. الأهم من ذلك، BST2 يمكن أن يتسبب عن طريق نوع-I IFN في عدد من خطوط الخلايا تحولت وكذلك في مزارع الخلايا الأولية من أصول الإنسان والفئران 6. وبصرف النظر عن وظيفة المناعة التنظيمية، تم العثور على BST2 مؤخرا لمنع الافراج عن HIV-1 وغيرها يلفها الجسيمات الفيروسية عن طريق جزيئات الفيروس الوليدة عبر ربط على سطح الخلية المصابة 7. في حالة HIV-1، وقد أظهرت ترميز فيروس الإكسسوارات البروتين U (VPU) ليكون بمثابة خصم BST2. ويعتقد أن معالج الجرافيك downregulates BST2 من سطح الخلية من الخلايا المصابة HIV-1، موقع حبل بهالنشاط جي، ونتيجة ليعزز إطلاق الفيروسي وتنتشر 7، على الرغم من أن هذه الفكرة قد طعن 8،9. في غياب VPU، وعدد كبير من تشكيلها بالكامل ويتم الاحتفاظ ذرية ناضجة HIV-1 الجزيئات على سطح الخلية. إذا كانت هذه الجزيئات المربوطة يمكن أن تمثل أهدافا فعالة للاستشعار المناعي لا يزال السؤال مفتوحا. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كان معالج الجرافيك يمكن dysregulate نوع-I الإنتاج IFN من pDCs عن طريق تحوير سطح مستويات BST2.
وقد أجريت دراسات مبكرة تهدف إلى تقييم HIV-1 الاستشعار باستخدام خالية من الخلايا HIV-1 الجسيمات، التي تعتبر عموما محرضات الفقيرة من النوع الأول IFN 3،10-12. وبالنظر إلى أن الدراسات الحديثة تشير إلى أن PBMCs وpDCs بمعنى بكفاءة المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 + T الليمفاوية 2،13،14، وصفنا هنا طريقة بسيطة لقياس الاستجابات الفطرية الناتجة عن pDCs عند التحقق من الخلايا المصابة HIV-1 في المختبر.
Protocol
ملاحظات عامة
فمن المهم للحفاظ على الخلايا في الثقافة دون أي مضاد حيوي، لأن العدوى البكتيرية حتى تسيطر يمكن لمست من قبل PBMCs. وهذا الاستشعار من مكونات بكتيرية تحفز على إنتاج الإنترفيرون الخلفية التي لا يمكن تمييزها عن تلك الناجمة عن معين HIV-1 الاستشعار عن بعد. وعلاوة على ذلك، فإن جميع الخلايا لديها لفحصها بشكل روتيني لعدم وجود تلوث الميكوبلازما.
دائما استخدام حلول خالية من الذيفان الداخلي كلما أمكن ذلك.
تدفق cytometric توصيف الخلايا المختلفة لاستخدامها في الثقافات المشتركة (PBMCs، pDCs، MT4 وخلايا CD4 + T) هو خطوة اختيارية، ولكن يوصى بشدة لأنها يمكن أن توفر معلومات قيمة اللازمة لتفسير السليم للتجربة معينة.
1. إعداد الخلايا المصابة الهدف
- الحفاظ على الإنسان CD4 + T خط الخلية MT4 في RPMI 1640 ميديوتستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، ويشار من الآن فصاعدا كما RPMI-1640 المتوسطة كاملة.
- عزل خلايا CD4 + T الابتدائية.
- عزل الخلايا وحيدة النواة من الدم المحيطي الإنسان عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي.
- عزل الخلايا الليمفاوية T + CD4 باستخدام خلايا CD4 + T مجموعة مختارة السلبية، بناء على توصيات الشركة الصانعة.
- تنشيط الخلايا اللمفية CD4 + T مع PHA-L (5 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة ومن ثم الحفاظ على الخلايا في RPMI-1640 المتوسطة كاملة تستكمل مع المؤتلف IL-2 (100 U / مل). تصيب الخلايا الأولية T 5 أيام بعد العزلة.
- إصابة الخلايا المستهدفة (MT4 T خط الخلية أو الخلايا CD4 + T الابتدائية مغاير).
- قبل يومين للمشاركة في الثقافة، ويصيب خلايا T مع HIV-1 فيروس. في مثال محدد هو موضح هنا استخدمت pNL4.3-GFP_ires_Nef النوع البري (WT) أو pNL4.3-GFP_ires_Nef دلتا معالج الجرافيك (dVpu) فيروسات. هذه السلالات الفيروسية تمثل GREأون البروتين الفلوري (GFP) -marked استنساخ الجزيئية المعدية إسوي التي تختلف فقط في قدرتها على التعبير عن معالج الجرافيك.
- استخدام مولتيبليكيتييس مختلفة من العدوى (موييس) وحدد الثقافات مع مستويات مماثلة من العدوى عن المشترك الثقافات. يوم الثقافة المشتركة، وتحديد نسبة GFP + الخلايا عن طريق التدفق الخلوي كعلامة للعدوى. استخدام الثقافات الوحيدة مع مجموعة من 20-50٪ الخلايا المصابة عن المشترك الثقافات.
الخطوات الاختيارية: إجراء تدفق cytometric تلطيخ في هذه المرحلة لتقييم التعبير سطح الجزيئات / بروابط من الاهتمام مثل BST2، وCD4. لتلطيخ سطح الخلية، و resuspend 0.5 × 10 6 T الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل، إضافة 1 ميكرولتر من مكافحة CD4_PerCP / Cy5.5 و1 ميكرولتر المضادة للBST2_A660. احتضان الأنابيب لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية، وذلك قبل غسل مع التدفق الخلوي محلول الغسيل. إذا وتهدف الدراسات إلى تقييم دور معالج الجرافيك بوساطة العداء BST2، إجراء HIV-1 الجسيماتالإفراج فحص في هذا الوقت كما هو موضح سابقا (15).
2. عزل وإثراء استشعار خلايا (PBMCs كامل أو pDCs المخصب)
ملاحظة: عند استخدام PBMCs للاستشعار، تبدأ العزلة داخل نصف ساعة بعد جمع الدم وإجراء ذلك في الوقت المناسب. استخدام PBMCs مباشرة للمشاركة في الثقافات أو تخصيب PDC.
- عزل الخلايا وحيدة النواة من الدم المحيطي الإنسان عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي.
خطوة اختيارية: قم بإجراء متعددة حدودي التدفق الخلوي تلطيخ للتأكد من أن PBMCs المعزولة حديثا تحتوي على الأنساب مختلفة من الخلايا في نسب الفسيولوجية. لتلطيخ سطح الخلية، و resuspend 10 6 PBMCs في 100 ميكرولتر من التيسير حل حظر، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد حظر، إضافة 1 ميكرولتر من مكافحة CD3_Pacific الأزرق (للخلايا T)، 1 ميكرولتر من مكافحة CD14-PE_Texas الأحمر (لخلايا الدم النخاعي)، 4 ميكرولتر المضادة للBDCA2_APC و1 ميكرولتر المضادة للILT7_PE (لpDCs). احتضانأنابيب لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية، وذلك قبل غسل مع التدفق الخلوي محلول الغسيل. - إثراء pDCs باستخدام مجموعة مختارة السلبية PDC، بناء على توصيات الشركة الصانعة. فمن المستحسن أن العمل بسرعة، والحفاظ على خلايا البرد، واستخدام حلول تبريد مسبقا. هذا سوف يمنع وضع حد أقصى من الأجسام المضادة على سطح الخلية ووضع العلامات الخلايا غير محددة فضلا عن ضمان النشاط PDC القصوى.
- أداء متعددة حدودي تحليل تدفق cytometric من قبل PDCs المعزولة حديثا لتأكيد نقاء، نسبة تخصيب اليورانيوم وكميات النسبية pDC- علامات سطح معين (مثل ILT7 وBDCA2). لتلطيخ سطح الخلية، و resuspend 10 4 pDCs في 100 ميكرولتر من التيسير حل حظر، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد حظر، إضافة 1 ميكرولتر من مكافحة CD3_Pacific الأزرق، 1 ميكرولتر من مكافحة CD14_PE_Texas الأحمر، 4 ميكرولتر المضادة للBDCA2_APC و1 ميكرولتر المضادة للILT7_PE. احتضان الأنابيب لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية، وذلك قبل غسل مع التدفق الخلوي حل غسل (PBS، 5ملي EDTA، 5٪ FBS). ينصح ما لا يقل عن 40٪ نقاء الحزب الديمقراطي المسيحي (إذا كانت المادة انطلاق لديها 0.4٪ PDC، وهذا سيكون معادلا لتخصيب 100 أضعاف).
3. المشارك ثقافة الخلايا المصابة CD4 + T وخلايا الاستشعار عن بعد (PBMCs كامل أو pDCs المخصب)
- مزيج 220 ميكرولتر من PBMCs (المخفف في 850،000 خلية / مل) أو 220 ميكرولتر من pDCs (بتركيز يتراوح بين 100،000 إلى 500،000 خلية / مل) مع 30 ميكرولتر من خلايا T المصابة (مخفف في 10 6 خلية / مل) لكل بئر في وU-القاع 96 لوحة جيدا.
- والضوابط، PBMCs لوحة أو pDCs وخلايا T وحدها. ضبط مستوى الصوت بشكل جيد إلى 250 ميكرولتر مع RPMI 1640 المتوسطة كاملة.
- تقييم الاستجابات الخلوية إلى ناهض معروف من TLR7 وTLR9 مسارات. تحقيقا لهذه الغاية، لوحة 220 ميكرولتر من PBMCs (المخفف في 850،000 خلية / مل) أو 200 ميكرولتر من pDCs (بتركيز يتراوح بين 100،000 إلى 500،000 خلية / مل) لكل بئر في U-أسفل 96 لوحة جيدا وإضافة TLR7 ناهض ( إيميquimod، التركيز النهائي: 2.5 ميكروغرام / مل) أو TLR9 ناهض (ODN 2216 الدليل السياسي الشامل-A، التركيز النهائي: 5 ميكرومتر). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل18-22 ساعة ومعالجتها بطريقة مماثلة إلى الثقافات المشترك هو موضح أدناه.
- احتضان المشترك الثقافات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل18-22 ساعة، ومن ثم نقلها إلى V-القاع 96 لوحة جيدا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س.
- نقل supernatants إلى شقة القاع 96 لوحة جيدا. ويمكن تخزين Supernatants في -80 ° C أو استخدامها للكشف عن نوع-I IFN على الفور.
- الخلايا resuspend المشارك مثقف في 2٪ امتصاص العرق وتحليلها باستخدام التدفق الخلوي. بسبب الاختلافات في حجم والتحبيب، وخلايا MT4 تتميز بسهولة من PBMCs أو pDCs استنادا على الجانب مبعثر (SS) مقابل الأمام مبعثر (FS) لمحات. إذا تم استخدام خلايا T الأولية باعتبارها الخلايا المستهدفة المصابين، وهذه يمكن أن تكون ملطخة مع أي صبغة تعقب الخلية، مثل CSFE، للمشاركة في الثقافة السابقة.
- قياس النشطة بيولوجيا نوع-I IFN باستخدام خلايا بيتا مراسل HEK الأزرق IFN-α /.
ملاحظة: تم إنشاء هذه الخلايا عن طريق ترنسفكأيشن مستقرة من الخلايا HEK293 مع STAT2 وIRF9 الجينات البشرية للحصول على نوع نشط بشكل كامل I الإنترفيرون إشارات الطريق. أنها تحتوي أيضا يفرز الفوسفاتيز القلوية (SEAP) مراسل الجينات تحت سيطرة IFN-α / بيتا محرض ISG54 المروج. تحفيز هذه الخلايا مع النوع الأول IFN ينشط JAK / STAT / ISGF3 مسار والحث على إنتاج SEAP.- الحفاظ على خلايا كلوة الأزرق IFN-α / β في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. لوحة منها في مناطق ذات كثافة من 50000 خلية لكل جيدا في شقة القاع 96 لوحة جيدا، في الحجم النهائي من 180 ميكرولتر.
- إضافة 20 ميكرولتر من شارك في ثقافة طاف على كل جانب من نسختين. يتطلب كل لوحة أيضا مجموعة من الضوابط والمعايير الداخلية (IFNα البشرية والتركيز النهائي من 100 U / مل إلى 2500 U / مل). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 18ساعة -22.
- تحديد مستويات النشاط الفوسفاتيز القلوية باستخدام حل QUANTI الأزرق، والذي يتغير من اللون الوردي إلى اللون الأرجواني / الأزرق في وجود الانزيم. إعداد QUANTI الأزرق بناء على توصيات الشركة الصانعة. إضافة 180 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر من شقة القاع 96 لوحة جيدا. إلى كل بئر أيضا إضافة 20 ميكرولتر من الناجم عن HEK الأزرق IFN-α / β خلايا supernatants، واحتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى يتطور اللون في آبار المراقبة IFN القياسية.
- تقييم مستويات SEAP باستخدام مقياس الطيف الضوئي في 620-655 نانومتر، وتحديد تركيز من نوع-I IFN بالاستقراء من الخطية جزء من منحنى IFN القياسية.
Representative Results
نظام المشاركة في الثقافة هو موضح في الشكل رقم 1 يسمح لدراسة للرقابة من HIV-1 الاستشعار الفطري. ونظرا لطبيعة المتغيرة من الخلايا الأولية، فمن المهم أن النسب الطبيعية من النخاعي وخلايا T (CD14 + وCD3 + على التوالي) ويلاحظ، كما هو الحال في المثال هو موضح في الشكل 2A. وعلاوة على ذلك، سوى عدد قليل من تنشيط خلايا تي (FS أعلى وأعلى مستويات CD3 بالمقارنة مع الخلايا غير المفعلة T) ومرغوب فيه في PBMCs الثقافات المعزولة حديثا. PBMCs مع نسب غير طبيعية بين مختلف أنواع الخلايا، وغالبا ما تكون غير قادرة على شن الاستجابة المناعية الفطرية المناسبة في المختبر، الأرجح بسبب النمط الظاهري تنشيط بالفعل نتيجة للعدوى مستمرة. الأهم من ذلك، فإن النسبة المئوية النسبية للpDCs يجب أن يتم تقييمها كما هو مبين في الشكل 2B. على الرغم من أن هذه النسبة يمكن أن تختلف 0،2-1،2٪، ويلاحظ النمط الظاهري الاستشعار الشاذ أيضا مع كل من اكستريMES من هذا النطاق. إثراء pDCs باستخدام اختيار السلبية غالبا ما ينتج 50-95٪ PDC النقاء، كما رأينا في الأمثلة اثنين من 2B في الشكل (92٪ و 72٪). ويرد مثال نموذج أولي للتجربة الكلية في أرقام 3 و 4. في هذا المثال، تم الخلايا المصابة MT4 مع pNL4.3-GFP_ires_Nef WT أو دلتا VPU لتحقيق العدوى 30٪ في وقت شارك في ثقافة (الشكل 3A). كما هو موضح سابقا، إلا أن العدوى بفيروس WT أدت إلى حدوث انخفاض ملموس التنظيم من BST2 السطح (الشكل 3B). بسبب الاختلافات في الحجم والتفاصيل، يمكن خلايا MT4 تمييزها بسهولة من PBMCs التدفق الخلوي (الشكل 4A). بعد الحضانة ثقافة مشتركة، PBMCs فقط في اتصال مع المعروف TLR7 أو TLR9 ناهض وPBMCs في اتصال مع HIV-1 كميات كبيرة الخلايا المصابة التي تم إصدارها من النوع الأول IFN (الشكل 4B). تم الكشف عن أي IFN في PBMCs وحدها، في PBMCs المشارك مكعبltured مع خلايا MT4 وهمية المصابة، أو في الخلايا المصابة MT4 وحدها (الشكل 4B). في المثال المعروضة هنا، تم العثور على الاستشعار الفطري للخلايا MT4 المصابة HIV-1 من قبل PBMCs إلى إجراء خفض كبير في وجود معالج الجرافيك.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي التصميم التجريبي SUP: طاف انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.
الشكل 2: توصيف المظهري من PBMCs طازجة معزولة والسكة الحديدpDCs iched. (A) التوزيع الطبيعي للخلايا الدم النخاعي وخلايا T التي لوحظت في PBMCs معزولة من متبرع سليم (النسبة المئوية للخلايا الدم النخاعي أن يتراوح بين 10-20٪ وخلايا T بين 55-65٪). كانت ملطخة عينة PBMCs باستخدام الأجسام المضادة fluorophore مترافق التي تعترف CD14 السطحية (الدم النخاعي النسب علامة) وCD3 (T علامة الخلية). (B) التوصيف المظهري من pDCs. قبل pDCs تخصيب يمثلون ما بين 0،2-1،2٪ من العدد الكلي للخلايا داخل PBMCs (0.99٪ في المثال معروضة). ويمكن تحديد هذه الخلايا يعتمد على التعبير عن علامات محددة، مثل BDCA2 وILT7 والحاضر على سطح الخلية. اختيار السلبية يمكن استخدامها لإثراء كبير في عدد من pDCs والقضاء على التلوث الضارة المحتملة، مثل CD14 + النخاعي الخلايا (تخصيب تصل إلى 92٪ و 72٪ في المثالين معروضة). مؤشرهاCK هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.
الرقم 3: توصيف الخلايا MT4 الهدف المصابة HIV-1 (A) النسبة المئوية للخلايا المصابة داخل الثقافات MT4 المصابين pNL4.3-GFP_ires_Nef WT أو dVpu على النحو الذي يحدده النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP. تم تقييم (B) خلية BST2 التعبير السطح في الخلايا المصابة بعد تلطيخ السطح. رسوم بيانية الرمادي شغل تمثل خلايا وهمية المصابة الملون مع مصل الأرنب قبل المناعي (مراقبة غير ملوثين)؛ رسوم بيانية المتبقية تمثل الخلايا الملون مع anti-BST2 المصل بولكلونل الأرنب. رسوم بيانية مع خطوط متصلة وتمثل السيطرة GFP سلبية (NEG) الخلايا؛ بينما رسوم بيانية مع الخطوط المنقطة تتوافق مع GFP إيجابية (نقاط البيع) الخلايا المصابة. يعني انفلونزاكثافة orescence يشار إلى (MFI) القيم لكل عينة. التدفق الخلوي تم تنفيذ وتحليلها كما هو موضح في الشكل رقم 2. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.
الرقم 4: ثقافة المشارك لPBMCs طازجة معزولة والخلايا MT4 T المصابة (A) مقارنة التدفق الخلوي ملامح FS / SS وحظ للخلايا T MT4 وحدها، PBMCs وحده، أو زملاء الثقافات بين PBMCs وخلايا T MT4. بسبب الاختلافات في الحجم والتفاصيل، يمكن خلايا T MT4 تمييزها بسهولة من PBMCs في المشترك الثقافات باستخدام التدفق الخلوي. (B) مثال ممثل كمية من النوع الأول IFN صدر بعد تحفيز PBMCs مع TLR7 أو TLR9 ناهض (مضت)، أو بعد التعاون مع الثقافات وهمية أو الخلايا MT4 المشار المصابين pNL4.3-GFP_ires_Nef WT أو dVpu. البيانات الأولية أظهرت كما OD 650 القيم والمقابلة converseion لنوع-I تركيز IFN أعرب في U / مل. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.
Discussion
البروتوكولات وصفها هنا قياس الاستشعار من خلايا T المصابين الموسومة GFP HIV-1 الفيروسات التي تختلف فقط في قدرتها على التعبير عن معالج الجرافيك، كما هو موضح في تقريرنا الأخير 18. ومع ذلك، يمكن بسهولة أن يتم تعديل هذه الأساليب لدراسة الاستشعار من الفيروسات لازال فضلا عن الفيروسات التي تفتقر إلى الجينات الفيروسية الأخرى التي يمكن أن تعدل الاستشعار الفطري. إذا، ينبغي تحديد الفيروسات المستخدمة لا تعبر عن GFP النسبة المئوية للخلايا المستهدفة المصابة عن طريق وسيلة أخرى قبل أن تشارك في الثقافة، مثل P24 (قفيصة) تلطيخ الخلايا والتدفق الخلوي أو P24 ELISA. وعلاوة على ذلك، هذه البروتوكولات يمكن استخدامها مع مختلف الخلايا المستهدفة T، بما في ذلك مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا المتاحة والخلايا الأولية.
الطرق الموضحة في هذه المخطوطة لديها عدد من المزايا بالمقارنة مع المنهجيات في وقت مبكر تستخدم لدراسة HIV-1 الاستشعار عن بعد. أولا وقبل كل شيء أنشئت من قبل عدد من المجموعات التي خالية من الخلايا HIV-1 صالمواد هي محرضات الفقيرة من النوع الأول IFN 2،13،14. وعلاوة على ذلك، فقد اعتمدت الدراسات المبكرة على الطرق القديمة القائمة على ELISA-IFNα لقياس كمية من النوع الأول IFN المنتجة. وجود قيود على هذا الأسلوب الكشف هو أن معظم كبار السن مجموعات IFNα ELISA قياس نوع واحد فقط من IFNα، في حين تطل على أنواع أخرى من IFNα وIFNβ. استخدام خطوط الخلايا مراسل وصف يتغلب على هذا القيد كما تركز على جميع أشكال النشطة بيولوجيا من الإنتيرفيرون نوع-I الإنسان يمكن قياسها في آن واحد. تقنية حساسة للغاية، وأقل تكلفة من الجيل الجديد من IFN ELISA عدة وللعديد من الجهات المانحة يمكن بسهولة أن يتم الكشف عن كميات كبيرة من النوع الأول IFN. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام مع النوع الأول IFN أساليب أخرى، تلا مثل ELISAs.
الخطوات الحاسمة: من المهم أن الجودة لجميع المكونات الخلوية (سواء الأهداف والمؤثرات) يمكن السيطرة عليها بإحكام. التلوث المحتمل، حتى عندما asymptomatic، يحتاج إلى مراقبة والسيطرة عليها. كما ذكرنا سابقا، والمضادات الحيوية التي تسيطر عليها التلوث الجرثومي غير متناظرة، ومسببات الأمراض بين الخلايا يحتمل الأخرى مثل الميكوبلازما، يمكن أن تولد الاستجابات المناعية مماثلة لتلك التي لوحظت بعد الإصابة HIV-1، وهي إنتاج نوع-I IFN. وعلاوة على ذلك، يتعين على جميع الكواشف أن تكون خالية من LPS أو السموم الداخلية المحتملة الأخرى. وبالمثل، رصد PBMCs وpDCs مهم أيضا لأن العينات البشرية كثيرا ما يمكن معبي العدوى المستمرة الكامنة، والتي قد تؤثر على الاستشعار العادي. نوصي دائما بما في ذلك ضوابط السلبية المقترحة، مثل غياب الخلايا المستهدفة وكذلك المشترك الثقافات مع خلايا وهمية المصابة. بقاء الخلايا المصابة مهمة للاستشعار عن الحزب الديمقراطي المسيحي الصحيح لأنه لا ينتج النوع الأول IFN التالية شارك في الثقافة مع خلايا أفكارك 2،14 أيضا.
واحد الحد المهم للتقنية هو الحاجة إلى الخلايا الأولية طازجة معزولة. وكان هذا الإجراء لا اختبار باستخدام PBMCs أو pDCs التي تم تجميدها أو الاحتفاظ بها في الثقافة إما سابقا. عزل PBMCs كثيفة العمالة وهذه الخلايا لها عمر محدود جدا. وعلاوة على ذلك، بروتوكولات موحدة لحماية ضد العوامل المسببة للأمراض التي تنتقل عن طريق الدم يجب استخدام أثناء العمل مع الدم البشري. غالبا ما تكون هناك عدة مصادر للتقلب المرتبطة بالعمل التي تنطوي على الخلايا البشرية المعزولة حديثا. ومن بين هذه الإجراءات المختلفة التي تنفذ لعزل هذه الخلايا، وتقلب الموروثة التي تواجهها من الجهات المانحة إلى الجهات المانحة. في حين أنه من المستحيل تجنب التباين بين الجهات المانحة، واستخدام الضوابط الإيجابية المقترحة، مثل قياس استجابة لمنبهات معروفة من TLR7 وTLR9 مسارات، من شأنه أن يوفر الرقابة الداخلية الهامة لهذه التجارب. لاحظنا أن استجابة قوية لمنبهات للمسار TLR9 يمكن أن تكون مرتبطة مع استجابة PDC صحية، في حين أن هناك حاجة إلى TLR7 مسار تستجيب للاستجابة المناسبة ضد HIV-1 3.
ق ق = "jove_content"> بناء على الملاحظات التي أبدتها الولايات المتحدة وغيرها 2، وغالبا ما لا حاجة إثراء pDCs من PBMCs. ومع ذلك، إذا كان التصميم التجريبي يتطلب ذلك (على سبيل المثال في سياق آخر، حيث هناك حاجة إلى استنزاف علامات محددة سطح PDC) اختيار السلبية هو الأفضل على اختيار إيجابية، حيث تبقى الخلايا خالية من الأجسام المضادة بعد عملية الاختيار. pDCs معزولة الخضوع لموت الخلايا المبرمج السريع في الثقافة. للتجارب التي تتطلب هذه الخلايا لتكون مثقف لفترة طويلة من الزمن، وسائل الإعلام ثقافة يمكن أن تستكمل مع IL-3. هذا خلوى يدفع PDC انتشار الأسلحة النووية ويمنع موت الخلايا المبرمج من 16. ومع ذلك، يحتاج IL-3 استخدام لرقابة مشددة منذ ذلك قد يؤدي إلى نضوج PDC أو تمييز.
الطريقة الموضحة هنا يجمع بين الهدف HIV-1 الخلايا المصابة مع PBMCs طازجة معزولة أو pDCs من أجل إعادة الخطوات الأولية المعنية خلال الاستشعار الفطري. هذه الطريقة سوف تكون بلا شك مفيدة للEXPLORه مبكرة الأحداث المناعية الفطرية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. على الرغم من أن البروتوكولات المرتبطة بها وتهدف إلى قياس نوع-I IFN، فإنها يمكن تعديله بسهولة لقياس الجزيئات الحيوية النشطة الأخرى التي أصدرت من pDCs عند التحقق من الخلايا المصابة. ويمكن أن تشمل هذه: نوع-III IFN (IFN-λ)، السيتوكينات الموالية للالتهابات (مثل TNF-α و IL-6) وCXCL10 كيموكينات، CCL4، وCCL5 17.
Acknowledgments
نشكر E. Massicotte وJ. الرب للمساعدة التقنية الخبراء خلال التدفق الخلوي والخلية فرز التجارب. أيضا، نود أن نشكر موظفي العيادات IRCM وجميع الجهات المانحة لتوفير عينات الدم. تم الحصول على عينات من الدم المحيطي من المانحين البالغين الأصحاء الذين أعطوا موافقة خطية أبلغت وفقا لإعلان هلسنكي تحت بروتوكولات البحوث المعتمدة من قبل أخلاقيات البحوث مراجعة مجلس إدارة معهد للأبحاث Cliniques مونتريال (IRCM). وقد تم الحصول على الكواشف التالية من خلال برنامج الكاشف NIH الإيدز، شعبة الإيدز، NIAID، المعاهد الوطنية للصحة: خلايا MT4 من الدكتور دوغلاس ريتشمان. وريلاينس اندستريز-2 الإنسان من الدكتور موريس جايتلي، هوفمان - لاروش شركة
الدكتور كوهين وهو حاصل على كرسي أبحاث كندا في Retrovirology الإنسان. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من CIHR (CIHR 111226) للدكتور كوهين ومن فون للبحوث كيبيك-سانتيه (FRQ-S) شبكة الإيدز الدكتور BEGO والدكتور كوهين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
| HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
| RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| FBS | Wisent | 080-150 | |
| Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
| CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
| Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
| PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
| Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. |
| Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
| ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
| Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
| QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
| Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
| Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
| 10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
| 10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
| 10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
| 2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
| anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
| anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
| anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
| anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
| anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
| anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |
References
- Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J.
- Lepelley, A., et al.
- Beignon, A. S., et al. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions. The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).
- Martinelli, E., et al. HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).
- Cao, W., et al. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction. The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).
- Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling. Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).
- McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions. PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).
- Manel, N., et al. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature. 467, 214-217 (2010).
- Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1. Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).
- Fonteneau, J. F., et al. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells. Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).
- Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids. Virology. 221, 113-119 (1996).
- Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration. Virology. 343, 256-266 (2005).
- Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin. Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).
- Grouard, G., et al. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).
- Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance. Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).
- Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).
