התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic
Summary
מנהל של שני אנלוגים של תימידין, edu וBrdU, בעכברים בהריון מאפשר הניתוח של התקדמות מחזור התא בעצבי ובתאים במוח העכבר העוברי. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את ההשפעות של מתח genotoxic, כוללים קרינה מייננת, בהתפתחות המוח.
Abstract
נוירונים בקליפת המוח נוצרים במהלך התפתחות מוח מסוגים שונים של תאי גזע ועצביים (NSPC), המהווים האפיתל המצפה את pseudostratified חדרים לרוחב של המוח העוברי. לחצי genotoxic, כגון קרינה מייננת, יש השפעות מזיקות ביותר על המוח המתפתח הקשורות לרגישות הגבוהה של NSPC. הבהרה של המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים תלויה באפיון של תגובת הנזק לדנ"א של סוגים מסוימים של תאים אלה, המחייב את השיטה מדויקת כדי לקבוע התקדמות NSPC דרך מחזור התא ברקמה הפגועה. כאן מוצג שיטה המבוססת על זריקות intraperitoneal רצופות של edu וBrdU בעכברים בהריון וגילוי נוסף של שני אנלוגים תימידין אלה בסעיפי העטרה של המוח העוברי. Edu וBrdU שניהם שולבו ב-DNA של תאים משכפלים בשלב S ומזוהים על ידי שתי טכניקות שונות (אזיד אונוגדן ספציפי, בהתאמה), המאפשר זיהוי סימולטני שלהם. Edu ומכתים BrdU לאחר מכן נקבעו לכל גרעין NSPC בפונקציה של המרחק שלה מהשוליים של החדר באזור רמת telencephalon הגבי. לכן טכניקת תיוג כפולה זו מאפשרת להבחין בתאים שהתקדמו דרך מחזור התא מאלו שהפעילו מחסום מחזור תא שמוביל לעצירת מחזור התא בתגובה לנזק לדנ"א.
דוגמא לניסוי שהוצגה, שבי edu הוזרק לפני ההקרנה וBrdU מייד לאחר והניתוחים שבוצע בשעה 4 לאחר הקרנה. פרוטוקול זה מספק ניתוח מדויק של תגובת הנזק לדנ"א החריף של NSPC בתפקודו של השלב של מחזור התא שבו הם נחשפים לקרינה. שיטה זו היא קלות transposable למערכות רבות אחרות על מנת לקבוע את ההשפעה של טיפול מסוים על התקדמות מחזור התא ברקמות חיות.
Introduction
במהלך התפתחות מוח עוברית, תאי עצב השלכה של קליפת המוח נוצרים באזור חדרית, האפיתל pseudostratified המורכב מסוגים שונים של גזע עצבי ובתאים (NSPC) של שהחדרים לרוחב קווים. בין NSPC, תאי גלייה רדיאלי (RGC), המשמשים כתאי גזע עצביים, עוברים הגירה גרעינית interkinetic (INM): הם מבצעים מיטוזה על פני השטח של החדר והשלב-S בגבול הבסיס של אזור חדרית (VZ) 1, 2,3. הם יכולים לחלק בין אם באופן סימטרי ליצירת שני RGC או לא סימטרי כדי ליצור RGC אחד ותא עצב אחד או תא ביניים אב (IPC) 4, 5. IPC להגר לשכבה שמעליה מתרבים הנקראת אזור subventricular (SVZ), שבו לאחר החלוקה סימטרית האחרון הם מייצרים שני נוירונים הקרנה בשלה 6-8. בניגוד לRGC, IPC אינו עובר INM (בדיקה ב 9). נוירונים חדשים שנוצרו migrאכלתי רדיאלית לאורך הסיבים רדיאליים דרך אזור ביניים (י. ז) כדי להגיע ליעד הסופי שלהם בצלחת בקליפת המוח (CP) 10, 8. התזמון המושלם של כל האירועים הללו הוא חיוני להתפתחות קליפת המוח נכונה. למשל מעבר מההפצה לבידול של אוכלוסיות עצביות נשלטת על ידי משך שלב G1 11, 12. ההתארכות של שלב G1 וקושרת וכך עם התמיינות תאים.
מתח genotoxic, כגון קרינה מייננת, התפתחות המוח יפגע קשות (שנסקרה ב13). אנחנו ואחרים הראו כי NSPC נוטה מאוד לאפופטוזיס מושרה קרינה 14, 15,16. קרינה מייננת לגרום להפסקות גדיל הדנ"א כפולות שהניזק החמור ביותר לתאים מתרבים. מרכיב חיוני אחד תגובת נזק לדנ"א (DDR) בתאי רכיבה על אופניים הוא ההפעלה של מחסומי מחזור תא ב/ מעברי M-G1 / S או G2 או במהלך Sשלב (מחסום התוך S) 17-21. הם חוסמים את התקדמות מחזור התא כדי לספק זמן לתיקון נזק לדנ"א או חיסול של תאים פגועים מדי. כתוצאה מכך, מוות של תאים, כמו גם התקדמות מחזור התא מעוכבת עשוי לשנות את התפתחות מוח בתגובה לחשיפה לקרינה מייננת 22-24. זה היה כך מעניין לפתח שיטה להעריך את הפעלת מחסומי מחזור התא בNSPC במוח העוברי של העכברים המוקרן.
ההתקדמות של מחזור התא באופן שיגרתי ואחרי שימוש בשילוב של אנלוגי תימידין, 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). BrdU משולב בשלב S של מחזור התא, כאשר ה-DNA הוא שכפול. השימוש בנוגדנים נגד BrdU מאפשר לאחר מכן זיהוי של תאים שהיו בשלב S במהלך הדופק של BrdU.
אנלוגי תימידין רומן, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (edu) הוא זוהה על ידי אזיד ניאון. הדרכים השונות כדי לזהות edu ו-B RDU לא חוצה להגיב 25, המאפשר זיהוי בו זמני של שני אנלוגים תימידין, וזה שימושי לחקר התקדמות מחזור התא. בדרך כלל תאים פעמו ראשונה עם edu ולאחר מכן פעמו עם BrdU, שבו הזמן בין שתי ההתאגדות נמשך כמה שעות 25, 26. תוספת של BrdU בתקשורת והתרבות המכילה edu תוצאות במעדיפות שילוב של BrdU לתוך DNA עם ההרחקה של EDU, בעוד בנוסף בו זמנית של edu 25 עם BrdU equimolar או חצי equimolar לתוצאות התקשורת בשילוב BrdU רק 27. זה מפשט את פרוטוקול התיוג הכפול על ידי ביטול הצעדים לשטוף, כי הם בדרך כלל נדרשו להסיר את התווית הראשונה מהתקשורת והתרבות לפני תוספת של התווית השנייה. זה גם הוא של עניין מיוחד עבור in vivo מחקר, שבו צעדי הכביסה אינם אפשריים, כדי לקבוע את העיתוי המדויק של כניסת שלב S או יציאה של אוכלוסיית תאים.
t "> לאחרונה, שיטה של תיוג כפול דופק במוח עכבר העוברי באמצעות edu ו23 BrdU, 24,22 פותחה כדי לנתח את התקדמות מחזור התא וINM של NSPC לאחר הקרנה ברחם. יתר על כן זה כבר הוכיח כי, במהלך שלב S, תאי עכבר לשכפל ראשון אזורי euchromatin ולאחר מכן heterochromatin pericentric 28,29,30. מעניין, heterochromatin pericentric של כרומוזומים שונים התקבצו בגרעיני interphasic כדי ליצור מוקדי heterochromatic הידוע גם בchromocenters ובקלות לזיהוי על ידי מכתים DAPI כמוקדים בהירים. לכן, stainings edu וBrdU ההפרש של euchromatin וchromocenters עזר לנו לנתח באופן מדויק יותר את התקדמות שלב S של NSPC.שיטה זו אפשרה להפגנה של חוסר לכאורה של מחסום G1 / S בNSCP 22-24, וזה די מפתיע שכן מחסום זה אמור להיות קריטי ליציבות הגנום. כמה expעיצובי erimental מבוססים על שילובים שונים של קטניות edu וBrdU שימשו כדי לנתח את התקדמות מחזור התא בtelencephalon הגחון ועל הגב. הנה, אנחנו נותנים דוגמא של פרוטוקולים המאפשרים המחקר של הנזקים אקוטי DNA של NSPC בתוך 4 שעות הראשונות שלאחר הקרנה ברחם של עוברי עכברי E14.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
תכנון הניסוי המתואר כאן מבוסס על שילוב של שעה edu 1.5 לפני הקרנה ושילוב של BrdU מייד לאחר ההקרנה אפשרה להפגנה שNSPCs מסוגל להפעיל S ומחסומי G2 / M אבל לא את מחסום G1 / S בשעת 1 st אחרי מתח genotoxic במוח העכבר העוברי. אנחנו ביצענו ניסויים אחרים בהם edu כבר הזריק בזמנים שונים לאחר ההקר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שהוביל לתוצאות הללו קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) תחת הסכם מענק N ° 323,267, מחברת חשמל הצרפתי (EDF) ומl' Agence Nationale de la משוכלל ונדיר – סנטה-Environnement et סנטה-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
