Vurdering af cellecyklusprogression af neurale stam-og stamcelle i Mouse hjernens udvikling efter Genotoksisk Stress
Summary
Administration af to analoger af thymidin, Edu og BrdU, i gravide mus tillader analyse af cellecyklus progression i neurale og stamceller i embryonale mus hjernen. Denne metode er nyttig til at bestemme virkningerne af genotoksisk stress, herunder ioniserende stråling under hjernens udvikling.
Abstract
Neuroner i hjernebarken genereres under hjernens udvikling af forskellige typer af neurale stam-og progenitorceller (NSPC), som danner en pseudostratified epitel foring laterale ventrikler i den embryonale hjerne. Genotoksiske belastninger, såsom ioniserende stråling, har meget skadelige virkninger på hjernens udvikling relateret til den høje følsomhed NSPC. Belysning af de cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret afhænger karakterisering af DNA beskadigelse respons af disse særlige typer af celler, som kræver en nøjagtig metode til at bestemme NSPC progression gennem cellecyklus i det beskadigede væv. Her er vist en metode baseret på successive intraperitoneale injektioner af edu og BrdU i gravide mus og yderligere påvisning af disse to thymidinanaloger i kronafsnit af embryonale hjernen. Edu og BrdU begge inkorporeret i DNA af replikerende celler under S-fasen og er opdaget af to forskellige teknikker (azid elleret specifikt antistof, henholdsvis), som letter deres samtidige detektion. Edu og BrdU farvning derefter bestemmes for hver NSPC kerne i funktion af dets afstand fra den ventrikulære margen i en standard region af dorsale telencephalon. Således denne dobbelte mærkning teknik gør det muligt at skelne mellem celler, som skred gennem cellecyklussen fra dem, der har aktiveret en cellecyklus checkpoint fører til cellecyklus i respons på DNA beskadigelse.
Et eksempel på eksperiment præsenteret, hvor Edu blev injiceret før bestråling og BrdU umiddelbart efter og analyser udføres inden 4 timer efter bestråling. Denne protokol giver en nøjagtig analyse af den akutte DNA beskadigelse respons NSPC som funktion af fasen af cellens cyklus, hvor de er blevet bestrålet. Denne metode er let overføres til mange andre systemer med henblik på at fastslå virkningen af en bestemt behandling på cellecyklusprogression i levende væv.
Introduction
Under fosterudviklingen hjernen, er projektion neuroner i hjernebarken genereret i ventrikulær zone, en pseudostratified epithel er sammensat af forskellige typer af neurale stam-og progenitorceller (NSPC) at linjer laterale ventrikler. Blandt NSPC de radiale glialceller (RGC), der tjener som neurale stamceller undergår interkinetic nuklear migration (INM): de udfører mitose ved overfladen af ventriklen og S-fase ved den basale grænse af ventrikulær zone (VZ) 1, 2,3. De kan dele enten symmetrisk til at generere to RGC eller asymmetrisk for at generere en RGC og en neuron eller en mellemliggende progenitorcelle (IPC) 4, 5. IPC migrere til en overliggende prolifererende lag kaldet subventricular zone (SVZ), hvor efter en sidste symmetrisk division, de genererer to umodne projektion neuroner 6-8. I modsætning til RGC, behøver IPC ikke undergår INM (revideret i 9). Nyligt genererede neuroner migrspiste radialt langs de radiale fibrene gennem den mellemliggende zone (IZ) for at nå deres endelige bestemmelsessted i det kortikale plade (CP) 10, 8. Den perfekte timing af alle disse begivenheder er afgørende for en korrekt kortikal udvikling. For eksempel skifte fra proliferation til differentiering af neurale progenitorpopulationer styres af G1 fasevarighed 11, 12. Forlængelse af G1 fasen korrelerer således med celledifferentiering.
Genotoksisk stress, såsom ioniserende stråling, alvorligt forringe hjernens udvikling (revideret i 13). Vi og andre har vist, at NSPC er meget tilbøjelige til stråling-induceret apoptose 14, 15,16. Ioniserende stråling inducerer DNA dobbelt streng pauser, der er de mest alvorlige skader på prolifererende celler. En væsentlig bestanddel af DNA skade responset (DDR) i cykling celler er aktiveringen af cellecykluskontrolpunkter ved G1 / S eller G2 / M overgange eller under Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. De blokerer cellecyklusprogression at give tid til DNA-beskadigelse reparation eller fjernelse af for beskadigede celler. Derfor kan celledød samt forsinket cellecyklusprogression ændre hjernens udvikling som reaktion på ioniserende stråling 22-24. Det var derfor interessant at udvikle en metode til at vurdere aktiveringen af cellecykluskontrolpunkter i NSPC i det bestrålede mus embryonale hjerne.
Progression af cellecyklus rutinemæssigt fulgt ved hjælp af inkorporering af en thymidin-analog, 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU). BrdU inkorporeret under S-fasen af cellecyklussen, da DNA replikeres. Anvendelsen af et antistof mod BrdU tillader derefter påvisning af celler, der var i S-fase under pulsen BrdU.
En ny thymidinanalog, 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (edu) detekteres af en fluorescerende azid. De forskellige måder at opdage Edu og B RDU ikke krydsreagerer 25 muliggør samtidig påvisning af såvel thymidinanaloger, hvilket er nyttigt til undersøgelse af cellecyklusprogression. Normalt cellerne først pulses med edu og derefter pulset med BrdU, hvor tiden mellem de to incorporations varer par timer 25, 26. Tilsætning af BrdU i dyrkningsmedier indeholdende edu resulterer i fortrinsvis inkorporering af BrdU i DNA'et med undtagelse af edu mens samtidig tilsætning af edu 25 med ækvimolær eller halv ækvimolær BrdU til medierne resulterer kun BrdU inkorporering 27. Dette forenkler den dobbelte mærkning protokol ved at fjerne de vasketrin, der normalt kræves for at fjerne den første etiket fra dyrkningsmediet før tilsætning af det andet mærke. Dette er også en særlig interesse for in vivo-undersøgelse, hvor vasketrinene ikke er muligt, at bestemme den præcise timing af ind-eller udrejse af cellepopulation S-fasen.
t "> For nylig en metode til dual-pulsmærkning i embryonale mus hjerne ved hjælp af Edu og BrdU 23, 24,22 er blevet udviklet til at analysere cellecyklusprogression og INM af NSPC efter in utero bestråling. Desuden er det blevet påvist, at under S-fasen, museceller replikerer først de eukromatin regioner og derefter pericentric heterochromatin 28,29,30. Interessant, at pericentric heterochromatin af forskellige kromosomer grupperet i interphasic kerner danner heterochromatic foci også kendt som chromocenters og let kan påvises ved DAPI farvning så lyse foci. Derfor differential edu og BrdU farvninger af eukromatin og chromocenters hjulpet os til at analysere mere præcist S fase progression af NSPC.Denne fremgangsmåde tillod påvisning af den tilsyneladende mangel på G1 / S checkpoint i NSCP 22-24, hvilket er ganske overraskende, da dette kontrolpunkt formodes at være kritisk for genom stabilitet. Adskillige experimental design baseret på forskellige kombinationer af edu og BrdU pulser er blevet anvendt til at analysere cellecyklusprogression i den ventrale og dorsale telencephalon. Her giver vi et eksempel på protokoller der tillader undersøgelse af den akutte DNA-skader i NSPC inden for de første 4 timer efter in utero bestråling af E14.5 musefostre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det eksperimentelle design her beskrevet baseret på inkorporering af Edu 1,5 time før bestråling og inkorporering af BrdU umiddelbart efter bestråling tilladt demonstrationen som NSPC-koder er i stand til at aktivere S og G2 / M checkpoints men ikke G1 / S kontrolpost i 1. timer efter en genotoksisk stress i føtal musehjerne. Vi har udført andre forsøg, hvor Edu er blevet indsprøjtet på forskellige tidspunkter efter bestråling og BrdU, bare 1 time før mus ofre, hvilket giver os mulighed for specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget støtte fra Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale n ° 323.267, fra Electricité de France (EDF) og fra l'Agence Nationale de la Recherche – Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
