Genotoxic तनाव के बाद तंत्रिका स्टेम और माउस विकासशील मस्तिष्क में पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का आकलन कोशिका चक्र प्रगति
Summary
Thymidine की दो analogs के प्रशासन, शिक्षा और BrdU, गर्भवती चूहों में भ्रूण माउस मस्तिष्क में तंत्रिका और पूर्वज कोशिकाओं में कोशिका चक्र प्रगति का विश्लेषण की अनुमति देता है. इस विधि के मस्तिष्क के विकास के दौरान विकिरण सहित genotoxic तनाव,, के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए उपयोगी है.
Abstract
सेरेब्रल कॉर्टेक्स के न्यूरॉन्स भ्रूण के मस्तिष्क के पार्श्व ventricles अस्तर एक pseudostratified उपकला रूप है जो तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार (NSPC) से मस्तिष्क के विकास के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं. इस तरह के विकिरण के रूप में genotoxic तनाव, NSPC की उच्च संवेदनशीलता से संबंधित विकासशील मस्तिष्क पर अत्यधिक हानिकारक प्रभाव पड़ता है. शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र की व्याख्या क्षतिग्रस्त ऊतकों में कोशिका चक्र के माध्यम से NSPC प्रगति निर्धारित करने के लिए एक सटीक विधि की आवश्यकता है जो कोशिकाओं के इन विशेष प्रकार के डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया की विशेषताओं पर निर्भर करता है. यहां गर्भवती चूहों और भ्रूण के मस्तिष्क के राज्याभिषेक वर्गों में इन दो thymidine analogues के आगे का पता लगाने में edu और BrdU की लगातार intraperitoneal इंजेक्शन के आधार पर एक विधि दिखाया गया है. Edu और BrdU दोनों एस चरण के दौरान नकल कोशिकाओं के डीएनए में शामिल कर रहे हैं और दो विभिन्न तकनीकों (azide या द्वारा पता चला रहे हैंउनके साथ पता लगाने की सुविधा है, जो एक विशिष्ट एंटीबॉडी, क्रमशः),. Edu और BrdU धुंधला हो जाना तो पृष्ठीय telencephalon का एक मानक क्षेत्र में निलय मार्जिन से इसकी दूरी के समारोह में प्रत्येक NSPC नाभिक के लिए निर्धारित कर रहे हैं. इस प्रकार इस दोहरे लेबलिंग तकनीक डीएनए की क्षति के जवाब में सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए अग्रणी एक सेल चक्र जांच की चौकी को सक्रिय किया है कि उन लोगों से सेल चक्र के माध्यम से प्रगति की है कि कोशिकाओं भेद देता है.
प्रयोग का एक उदाहरण edu तुरंत बाद विकिरण और BrdU पहले इंजेक्ट किया गया था और विकिरण निम्नलिखित 4 घंटा के भीतर प्रदर्शन का विश्लेषण जो में, प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल वे विकिरणित किया गया है, जिस पर सेल चक्र के चरण के समारोह में NSPC की तीव्र डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया का एक सटीक विश्लेषण प्रदान करता है. इस विधि जीवित ऊतकों में कोशिका चक्र प्रगति पर एक विशेष उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए आसानी से transposable कई अन्य प्रणालियों के लिए है.
Introduction
भ्रूण के मस्तिष्क के विकास के दौरान, सेरेब्रल कॉर्टेक्स का प्रक्षेपण न्यूरॉन्स तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NSPC) के विभिन्न प्रकार से बना एक pseudostratified उपकला लाइनों है कि पार्श्व निलय, निलय क्षेत्र में उत्पन्न कर रहे हैं. NSPC के अलावा, तंत्रिका स्टेम सेल के रूप में काम जो रेडियल glial कोशिकाओं (RGC), (INM) interkinetic परमाणु प्रवास गुजरना: वे निलय क्षेत्र के बेसल सीमा पर वेंट्रिकल और एस चरण की सतह पर पिंजरे का बँटवारा प्रदर्शन (VZ) 1, 2,3. वे विभाजित कर सकते हैं या तो संतुलित रूप से दो RGC उत्पन्न करने के लिए या asymmetrically एक RGC और एक न्यूरॉन या एक मध्यवर्ती पूर्वज सेल (आईपीसी) 4, 5 उत्पन्न करने के लिए. आईपीसी पिछले एक सममित विभाजन के बाद वे दो अपरिपक्व प्रक्षेपण न्यूरॉन्स 6-8 उत्पन्न जहां subventricular क्षेत्र कहा जाता है एक overlying proliferating परत (SVZ), की ओर पलायन. RGC के विपरीत, भारतीय दंड संहिता (9 में समीक्षा) INM से गुजरना नहीं है. नव सृजित न्यूरॉन्स migrcortical प्लेट (सीपी) 10, 8 में अपने अंतिम गंतव्य तक पहुंचने के मध्यवर्ती क्षेत्र (IZ) के माध्यम से रेडियल फाइबर साथ त्रिज्यात खा लिया. इन सभी घटनाओं का सही समय एक सही cortical विकास के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए तंत्रिका पूर्वज आबादी के भेदभाव को प्रसार से स्विच G1 चरण की अवधि 11, 12 के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. G1 चरण की लंबी सेल भेदभाव के साथ इस प्रकार इसे संबद्ध.
इस तरह के (13 में समीक्षा) विकिरण, गंभीर रूप से क्षीण मस्तिष्क के विकास के रूप में genotoxic तनाव,. हम और दूसरों NSPC विकिरण प्रेरित apoptosis 14, 15,16 को अत्यधिक प्रवण हैं कि पता चला है. आयनीकरण विकिरण proliferating कोशिकाओं के लिए सबसे गंभीर नुकसान कर रहे हैं कि डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता प्रेरित. साइकिल कोशिकाओं में डीएनए की क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) की एक आवश्यक घटक G1 / एस या G2 / एम संक्रमण पर या एस के दौरान सेल चक्र चौकियों की सक्रियता हैचरण (इंट्रा एस जांच की चौकी) 17-21. वे डीएनए की क्षति की मरम्मत या भी क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए समय प्रदान करने के लिए सेल चक्र प्रगति ब्लॉक. नतीजतन, कोशिका मृत्यु के साथ ही देरी सेल चक्र प्रगति विकिरण जोखिम 22-24 ionizing के जवाब में मस्तिष्क के विकास को बदल सकता है. यह विकिरणित माउस भ्रूण के मस्तिष्क में NSPC में सेल चक्र चौकियों की सक्रियता का आकलन करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए इस प्रकार दिलचस्प था.
सेल चक्र की प्रगति नियमित रूप से एक thymidine अनुरूप, 5 ब्रोमो 2'-deoxyuridine (BrdU) के समावेश का उपयोग कर पीछा किया जाता है. BrdU डीएनए नकल है जब सेल चक्र, के एस चरण के दौरान शामिल किया है. BrdU के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग BrdU की नब्ज दौरान एस चरण में थे कि कोशिकाओं की उसके बाद पता लगाने की अनुमति देता है.
एक उपन्यास thymidine अनुरूप, 5 Ethynyl 2'-deoxyuridine (edu) एक फ्लोरोसेंट azide ने पता लगाया है. edu और बी का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीके RDU सेल चक्र प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जो दोनों thymidine analogs के साथ पता लगाने, सक्षम करने, 25 पार प्रतिक्रिया नहीं है. आम तौर पर कोशिकाओं पहले edu के साथ स्पंदित और फिर दोनों incorporations के बीच के समय घंटे 25, 26 के जोड़े रहता है जहां BrdU, साथ स्पंदित कर रहे हैं. Edu युक्त संस्कृति मीडिया में BrdU के अलावा edu के बहिष्कार के साथ डीएनए में BrdU की रियायत के समावेश में यह परिणाम है, जबकि केवल BrdU समावेश 27 में मीडिया के परिणाम को equimolar या आधा equimolar BrdU साथ edu 25 के एक साथ इसके अलावा. यह सामान्य रूप से पहले दूसरा लेबल के अलावा संस्कृति मीडिया से पहले लेबल को दूर करने के लिए आवश्यक हैं कि धोने के कदम को नष्ट करने से दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल सरल करता है. यह भी एस चरण प्रविष्टि या सेल की आबादी के बाहर निकलने का सटीक समय निर्धारित करने के लिए धोने कदम संभव नहीं हैं जहां vivo में अध्ययन, के लिए एक विशेष रुचि का है.
टी "> हाल ही में, edu और BrdU 23, 24,22 का उपयोग भ्रूण माउस मस्तिष्क में दोहरे पल्स लेबलिंग की एक विधि utero विकिरण में बाद सेल चक्र प्रगति और NSPC की INM का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है. इसके अलावा यह प्रदर्शन किया गया है के दौरान, कि एस चरण, माउस कोशिकाओं पहले euchromatin क्षेत्रों और फिर pericentric हेट्रोक्रोमैटिन 28,29,30 को दोहराने. दिलचस्प है, interphasic नाभिक में क्लस्टर अलग गुणसूत्रों की pericentric हेट्रोक्रोमैटिन भी chromocenters के रूप में जाना जाता है और उज्ज्वल foci के रूप में DAPI धुंधला द्वारा आसानी से detectable heterochromatic foci के रूप में. इसलिए, euchromatin और chromocenters का अंतर edu और BrdU stainings ज्यादा ठीक NSPC के एस चरण प्रगति का विश्लेषण करने के लिए हमारी मदद की.इस विधि में इस जांच की चौकी जीनोम स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है क्योंकि बहुत आश्चर्य की बात है जो NSCP 22-24 में G1 / एस जांच की चौकी, की स्पष्ट कमी के प्रदर्शन की अनुमति दी. कई ऍक्स्पedu और BrdU दालों के विभिन्न संयोजनों पर आधारित erimental डिजाइन उदर और पृष्ठीय telencephalon में सेल चक्र प्रगति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम E14.5 माउस भ्रूण की गर्भ विकिरण में निम्नलिखित पहले 4 घंटे के भीतर NSPC की तीव्र डीएनए की क्षति के अध्ययन की अनुमति प्रोटोकॉल का एक उदाहरण दे.
Protocol
Representative Results
Discussion
edu 1.5 घंटे का समावेश पर आधारित यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइन से पहले विकिरण की अनुमति दी तुरंत बाद विकिरण और BrdU का समावेश NSPCs एक के बाद एस और G2 / एम चौकियों को सक्रिय करने में सक्षम है, लेकिन 1 घंटा दौरान G1 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sante-Environnement – इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान ELECTRICITE डी फ्रांस (EDF) से और ल Agence Nationale डे ला Recherche से, 323,267 अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से धन प्राप्त n ° गया है एट SANTE-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
