Uppskatta cellcykelprogression av neurala stam och progenitorceller i musen framkallande hjärnan efter genotoxisk stress
Summary
Administration av två analoger av tymidin, EDU och BrdU, i gravida möss kan analys av cellcykelprogression i neurala och progenitorceller i den embryonala mushjärna. Denna metod är användbar för att bestämma effekterna av genotoxisk stress, inklusive joniserande strålning, under hjärnans utveckling.
Abstract
Neuroner i hjärnbarken genereras under hjärnans utveckling från olika typer av neurala stamceller och progenitorceller (NSPC), vilka bildar en pseudostratified epitel kantar laterala ventriklarna hos den embryonala hjärnan. Genotoxiska påfrestningar, såsom joniserande strålning, har mycket skadliga effekter på den växande hjärnan i samband med den höga känsligheten hos NSPC. Klarläggande av de cellulära och molekylära mekanismer som är inblandade beror på karakterisering av DNA-skador svar på dessa särskilda typer av celler, vilket kräver en noggrann metod för att bestämma NSPC progression genom cellcykeln i den skadade vävnaden. Här visas en metod som bygger på varandra följande injektion i bukhålan EDU och BrdU i dräktiga möss och ytterligare upptäckt av dessa två tymidinanaloger i frontala delar av embryonala hjärnan. EDU och BrdU är båda inkorporeras i DNA av replikerande celler under S-fasen och detekteras av två olika tekniker (azid elleren specifik antikropp, respektive), vilket underlättar deras samtidig detektion. EDU och BrdU färgning skall sedan bestämmas för varje NSPC kärna som funktion av dess avstånd från kammar marginalen i en standard region i rygg telencefalon. Således denna dubbla märkningsteknik möjliggör att skilja celler som utvecklats genom cellcykeln från dem som har aktiverat en cellcykelkontrollpunkten som leder till cellcykelarrest som svar på DNA-skador.
Ett exempel på experiment presenteras, där Edu injicerades före bestrålning och BrdU direkt efter och analyser som utförs inom 4 timmar efter bestrålning. Detta protokoll ger en korrekt analys av den akuta DNA-skador svar av NSPC i funktion av fasen av cellcykeln där de har bestrålats. Denna metod är lätt överföras till många andra system för att bedöma effekten av en viss behandling på cellcykelprogression i levande vävnader.
Introduction
Under embryohjärnutveckling är projektions neuroner i hjärnbarken som genereras i den ventrikulära zonen en pseudostratified epitel sammansatt av olika typer av neurala stam och progenitorceller (NSPC) som linjer de laterala ventriklarna. Bland NSPC de radiella gliaceller (RGC), som tjänar som neurala stamceller, genomgå interkinetic nukleär migrering (INM): de utför mitos vid ytan av ventrikeln och S-fas vid den basala gränsen för den ventrikulära zonen (VZ) 1, 2,3. De kan dela antingen symmetriskt för att generera två RGC eller asymmetriskt för att generera en RGC och en neuron eller en mellan stamcellstransplantation (IPC) 4, 5. IPC migrera till ett överliggande förökar skikt kallas subventrikulära zonen (SVZ), där efter en sista symmetrisk delning de genererar två omogna projektion nervceller 6-8. I motsats till RGC behöver IPC inte genomgår INM (över i 9). Newly generated neurons stråt radiellt längs radiella fibrerna genom den mellanliggande zonen (IZ) för att nå sin slutdestination i kortikala plattan (CP) 10, 8. Den perfekta tiden för alla dessa händelser är avgörande för en korrekt kortikal utveckling. Till exempel övergången från proliferation till differentiering av neurala progenitorceller populationer styrs av G1 fasvaraktighet 11, 12. I förlängningen av G1 fasen korrelerar således med celldifferentiering.
Genotoxisk stress, såsom joniserande strålning, vilket allvarligt försämrar hjärnans utveckling (översikt i 13). Vi och andra har visat att NSPC är mycket utsatta för strålning-inducerad apoptos 14, 15,16. Joniserande strålning inducerar DNA-dubbelsträngsbrott, som är den allvarligaste skada på prolifererande celler. En viktig del av DNA-skador svar (DDR) i cykel celler är aktiveringen av cellcykelkontrollpunkter vid G1 / S eller G2 / M övergångar eller under Sfas (intra-S checkpoint) 17-21. De blockerar cellcykelprogression att ge tid för DNA-skada reparation eller eliminering av alltför skadade celler. Följaktligen kan celldöd samt försenade cellcykelprogressionen förändrar hjärnans utveckling som svar på joniserande strålning 22-24. Det var därför intressant att utveckla en metod för att bedöma aktivering av cellcykelkontrollpunkter i NSPC i det bestrålade musen embryonala hjärnan.
Progressionen av cellcykeln är rutinmässigt med användning av inkorporering av en tymidin-analog, 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU). BrdU införlivas under S-fasen av cellcykeln, när DNA replikerar. Användningen av en antikropp mot BrdU tillåter därefter detektion av celler som var i S-fasen under pulsen av BrdU.
A novel tymidin-analog, 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EDU) detekteras genom en fluorescerande azid. De olika sätt att upptäcka EDU och B RDU inte korsreagerar 25, vilket möjliggör samtidig detektion av både tymidinanaloger, som är användbar för studium av cellcykelprogression. Vanligtvis celler först pulsas med EDU och sedan pulsades med BrdU, där tiden mellan de båda inkorporeringar varar några timmar 25, 26. Tillsats av BrdU i odlingsmedier innehållande edu leder preferentiellt inkorporering av BrdU i DNA med undantag av EDU, medan samtidig tillsats av EDU 25 med ekvimolär mängd eller halv ekvimolär BrdU till media resulterar i endast BrdU-inkorporering 27. Detta förenklar dubbel märkning protokoll, genom att avlägsna tvättstegen som normalt krävs för att ta bort den första etiketten från odlingsmediet före tillsatsen av den andra etiketten. Detta är också av särskilt intresse för in vivo-undersökning, där tvättningsstegen inte är möjligt att fastställa den exakta tidpunkten för S-fas in på eller lämnar cellpopulationen.
t "> Nyligen, en metod med dubbla pulsmärkning i embryonala mus hjärnan med EDU och BrdU 23, 24,22 är utvecklad för att analysera cellcykelprogression och INM av NSPC efter in utero-bestrålning. Vidare har det visats att, under S-fasen, musceller replikerar först de eukromatin regionerna och sedan den pericentric heterokromatin 28,29,30. Intressant att pericentric heterokromatin olika kromosomer klustrade i interphasic kärnor bildar heterochromatic härdar även känd som chromocenters och enkelt upptäckas av DAPI färgning som ljusa härdar. Därför differential EDU och BrdU färgningar av eukromatin och chromocenters hjälpt oss att mer exakt analysera S-fasen progression av NSPC.Denna metod tillät demonstration av den uppenbara bristen på G1 / S checkpoint i NSCP 22-24, vilket är ganska förvånande eftersom denna kontrollpunkt är tänkt att vara avgörande för genomet stabilitet. Flera experimental konstruktioner baserade på olika kombinationer av EDU och BrdU-pulserna har använts för att analysera cellcykelprogression i den ventrala och dorsala telencephalon. Här ger vi ett exempel på protokoll som medger undersökning av den akuta skador på DNA av NSPC inom de första 4 tim efter i livmodern bestrålning av embryon E14.5 mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den experimentella designen som beskrivs här grundar sig på inkorporering av edu 1,5 h före bestrålning och inkorporeringen av BrdU omedelbart efter bestrålning tillät demonstration av att NSPCs kan aktivera S och G2 / M kontrollpunkter, men inte G1 / S checkpoint under en st h efter en genotoxisk stress i fostrets musen hjärnan. Vi utförde andra experiment där EDU har injicerats vid olika tidpunkter efter bestrålning och BrdU, bara 1 timme före möss uppoffringar, vilket tillåter oss att särskil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit finansiering från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal n ° 323.267, från Electricité de France (EDF) och från l'Agence Nationale de la Recherche – Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
