Genotoksik Stres sonrası nöral kök ve Fare Gelişmekte Beyin Progenitör Hücrelerinin Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü İlerlemesi
Summary
Timidin iki analoglarının Yönetimi, edu ve BrdU, hamile farelerde embriyonik fare beyninde sinir ve progenitör hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin analizine izin verir. Bu yöntem, beyin gelişimi sırasında iyonizan radyasyon içeren genotoksik stres, etkilerini belirlemek için yararlıdır.
Abstract
Serebral korteks nöronlar embriyonik beynin lateral ventriküller astar bir yalancı epiteli oluşturan nöral kök hücrelerin farklı (NSPC), beyin gelişimi sırasında oluşturulur. Gibi iyonize radyasyon gibi genotoksik stresler, NSPC yüksek duyarlılığı ile ilgili gelişen beyin üzerinde son derece zararlı etkileri vardır. Dahil hücresel ve moleküler mekanizmaların açıklanması, hasarlı doku, hücre döngüsü boyunca NSPC ilerlemesi belirlemek için güvenilir bir yöntem gerektirir hücreleri, bu özel tiplerinin DNA hasarı yanıtın karakterizasyonu bağlıdır. Burada hamile farelerde embriyonik ve koronal beyin bölümlerinde bu iki timidin analogları daha saptanmasında edu ve BrdU ardışık intraperitonal enjeksiyonlar göre bir yöntem gösterilmektedir. Edu ve BrdU hem S fazında kopyalayan hücre DNA olarak dahil edilmiştir ve iki farklı teknikler (azid ile tespit edilir ya dabunların aynı anda algılanmasını kolaylaştırmak spesifik bir antikor, sırasıyla). Edu ve BrdU boyama daha sonra dorsal telencephalon standart bir bölgede ventriküler kenar onun mesafesinin bir fonksiyonu olarak her bir NSPC çekirdeği için belirlenir. Bu nedenle bu çift etiketleme tekniği DNA hasarına tepki olarak hücre siklüs hapsinin yol açan bir hücre döngüsü kontrol noktası aktive olması, bu ikinci hücre döngüsü yoluyla ilerleme hücreleri ayırt sağlar.
Deneyin bir örnek edu hemen sonra ışınlama ve BrdU önce enjekte edilmiş ve ışınlama sonra 4 saat içinde analiz yapılmıştır ki, sunulmuştur. Bu protokol ışınlanır edilmiş hangi hücre döngüsü faz fonksiyonunda NSPC akut DNA hasarı yanıtın doğru bir analizini sağlar. Bu yöntem, canlı dokuda, hücre devir gelişiminin belirli bir tedavinin etkisini tespit etmek amacıyla kolayca yer değiştirebilir diğer sistemlerin etmektir.
Introduction
Embriyonik beyin gelişimi sırasında, serebral korteksin projeksiyon nöronlar nöral kök ve progenitör hücrelerin (NSPC) farklı türde oluşan bir yalancı epitel bu satırları yan ventrikül, ventriküler bölge oluşturulur. NSPC arasında, nöral kök hücre olarak hizmet eden radyal glial hücreleri (RGC), (INM) interkinetic nükleer göç tabi tutulur: bunlar ventriküler bölgesinin bazal sınırında ventrikül ve S-fazı yüzeyinde mitoz yerine (VZ) 1., 2,3. Bölündüklerinde ya simetrik iki RGC oluşturmak için ya da asimetrik bir RGC ve bir nöron veya bir ara progenitör hücre (IPC) 4, 5 üretir. IPC son bir simetrik bölünme sonra da iki olgunlaşmamış projeksiyon nöronları 6-8 üretmek bölge subventricular denilen bir üstteki çoğalan tabakası (SVZ), göç. RGC aksine, IPC (9 gözden) Inm girmezler. Yeni üretilen nöronlar Migrkortikal plaka (CP) 10, 8 onların nihai hedefe ulaşmak için ara bölge (IZ) ile radyal lifleri boyunca radyal yedik. Tüm bu olayların mükemmel zamanlama doğru kortikal gelişim için gereklidir. Örneğin nöral projenitör popülasyonlarının farklılaşma çoğalmasından anahtar G1 faz süresi 11, 12 tarafından kontrol edilir. G1 fazının uzatılması hücre farklılaşması ile bu şekilde ilişkilidir.
Bu tür (13 gözden) iyonize radyasyon, bozan beyin gelişimi gibi genotoksik stres. Biz ve diğerleri NSPC radyasyon kaynaklı apoptoz 14, 15,16 derece yatkın olduğunu göstermiştir. İyonlaştırıcı ışınım çoğalan hücrelere en ağır hasarı DNA çift iplikli kırılmalara neden. Bisiklet hücrelerde DNA Damage Müdahale (DDR) esas bir bileşeni, G1 / S ya da G2 / M geçişlerinde ve S esnasında hücre siklüs kontrol noktalarının aktivasyonufaz (intra-S kontrol noktası) 17-21. Bunlar, DNA hasarı tamiri ya da çok hasar görmüş hücrelerin ortadan kaldırılması için zaman sağlamak için, hücre döngüsü ilerlemesini bloke eder. Sonuç olarak, hücre ölümü hem de gecikmiş hücre döngüsü ilerlemesi radyasyona maruz 22-24 iyonize yanıt beyin gelişimini değiştirebilir. Bu ışınlanmış fare embriyonik beyin NSPC hücre döngüsü kontrol noktası aktivasyonunu değerlendirmek için bir yöntem geliştirmektir, böylece ilginçti.
Hücre döngüsünün ilerlemesi rutin bir timidin analogu, 5-Bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) 'nin bileşimi kullanılarak takip edilir. BrdU DNA çoğaltma işlemini hücre döngüsünün S fazı esnasında dahil edilmektedir. BrdU karşı bir antikorun kullanılması BrdU darbesi sırasında S fazında olan hücreler daha sonra belirlenmesini sağlar.
Bir yeni timidin analogu, 5-etinil-2'-deoksiuridin (EGT), floresan azit ile tespit edilir. Edu ve B tespit etmek için farklı yolları RDU hücre döngüsü ilerlemesinin çalışma için yararlı olan iki timidin analogları aynı anda algılama sağlayan, 25, çapraz reaksiyona girmezler. Genellikle hücreler ilk edu ile darbeli ve daha sonra her iki birleştirmeleri arasındaki süre sonrası 25, 26 bir çift sürer BrdU, ile birlikte titreşim uygulanır. Edu ihtiva eden kültür ortamı içinde BrdU eklenmesi edu hariç olmak üzere DNA'ya BrdU tercihli olarak dahil sonuçlanır ise sadece BrdU dahil 27 ortam sonuçlara eşit mol ya da eşit molar yarım BrdU ile edu 25 eşzamanlı eklenmesi. Bu, normal olarak önce ikinci etiketin ilave etmek için kültür ortamından birinci etiket çıkarmak için gerekli olan yıkama adımları ortadan kaldırarak çift etiketleme protokolü kolaylaştırır. Bu, aynı zamanda, S fazına girişin ya da hücre nüfusunun çıkış kesin zamanlama belirlemek için yıkama adımları mümkün olmayan in vivo çalışmada,, için özel bir önem taşımaktadır.
t "> Son zamanlarda, edu ve BrdU 23, 24,22 kullanılarak embriyonik fare beyninde çift nabız da etiketlenmesi için bir yöntem utero ışınlama sonra hücre döngüsü ilerlemesini ve NSPC İNM analiz etmek için geliştirilmiştir. Üstelik gösterilmiştir sırasında, bu S fazı, fare hücreleri ilk Ökromatin bölgeleri ve daha sonra perisentrik heterokromatine 28,29,30 çoğaltmak. İlginçtir, interphasic çekirdeklerinde kümelenmiş farklı kromozomlar perisentrik heterokromatinin da chromocenters olarak bilinen ve parlak odakları olarak DAPI boyama tarafından kolayca tespit heterokromatik odağı oluşturması. Bu nedenle, ökromatin ve chromocenters diferansiyel Edu ve BrdU boyamaları daha doğrusu NSPC S fazı ilerlemesini analiz için bize yardımcı oldu.Bu yöntem, bu kontrol noktası genom istikrar açısından kritik olması gerekiyordu çünkü oldukça şaşırtıcı NSCP 22-24 G1 / S kontrol noktasında, belirgin eksikliği gösteri sağladı. Çeşitli expedu ve BrdU bakliyat çeşitli kombinasyonlarına dayanan tasarımları erimental ventral ve dorsal telencephalon hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmek için kullanılmıştır. Burada, E14.5 fare embriyo utero ışınlama sonraki ilk 4 saat içinde NSPC akut DNA hasarının çalışma sağlayan protokollerin bir örnek verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Edu 1.5 saat katılmasıyla göre burada anlatılan deneysel tasarım önce ışınlama izin hemen sonra ışınlama ve BrdU birleşme NSPCs bir sonra S ve G2 / M kontrol noktaları etkinleştirmek mümkün ancak 1 st saat boyunca G1 / S noktası değildir gösteri fetal fare beyninde genotoksik stres. Bize özel olarak, S fazına girişin oranını takdir izin edu sadece 1 saat farenin kurban öncesinde, ışınlama ve BrdU sonra farklı zamanlarda enjekte edildiği ve diğer deneyler gerçekleştirilmiştir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şerefe-ENVIRONNEMENT – bu sonuçlara yol açan araştırma Electricité de France (EDF) dan ve l'Agence Nationale de la Recherche dan, 323.267 hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı n ° etti et Santé-Travail'in (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
