בVivo siRNA Transfection וג'ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

סיכום

דו"ח זה מתאר טכניקה פשוטה ומהירה של נקב מחט intrathecal עבור transfection מקומי של siRNA בחוט השדרה המותני בעכבר תחת הרדמה קצרה אור בר קיימא.

תקציר

דו"ח זה מתאר את מדריך צעד אחר צעד לטכניקה של הזרקות מחט intrathecal חריפות בצורה לא פולשנית, כלומר העצמאית של השתלת קטטר. המגבלה הטכנית של טכניקה ניתוחית זו נעוצה בעידון של הידיים. הזריקה היא מהירה, במיוחד עבור הנסיין מיומן, וכן שיבוש רקמות עם טכניקה זו הוא מינימאלי, זריקות חוזרות ונשנות אפשריות; תגובת יתר על כן חיסון לכלים זרים (. למשל קטטר) אינה מתרחשת, ובכך נותנת ספציפי טוב יותר ויותר לקרוא את של אפנון חוט השדרה. מאז היישום של החומר מוגבל במידה רבה לאזור היעד של חוט השדרה, תרופות לא צריכה להיות מיושמות במינונים גדולים, ואת השפעות חשוב יותר לא רצויות ברקמות אחרות, כפי שנצפתה עם משלוח מערכתי, יכולה לעקוף ^{1, 2.} יתר על כן, אנו משלבים בטכניקה זו עם transfection vivo של חומצות גרעין בעזרת polyethylenimine (PEI) מגיב ^3, המספק גמישות עצומה ללימוד פונקציות השדרה באמצעות משלוח של סוכנים תרופתיים כמו גם גנים, RNA, ומאפנני חלבון.

מבוא

חוט השדרה הוא מרכז חשוב מאוד במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים מרכזיים ופונקציות פיסיולוגיות, לרבות עיבוד והעברה של תשומות כואבות (nociceptive) ^4-7. ניסיוני בטכניקות שונות פותחו כדי להקל על אפנון תרופתי של חוט השדרה, כגון השתלה כרונית של צנתרים intrathecal ^8, microinjection חוט השדרה, והזרקת מחט intrathecal ^9. לכל אחד יש טכניקת יתרונות משלה וחסרונות, ובהתאם לפרדיגמה ניסוי טכניקה אחת יכולה להיות מתאימה יותר מאשר לאחרים. ואילו השתלה כרונית של צנתרים intrathecal אינה ריאלי בקלות בחולדה, בשיטה זו קשה מאוד בעכבר, בהתחשב במגבלות גודל. שיעור הצלחה הוא נמוך מאוד וליקויים מוטוריים מתרחשים לעתים קרובות בשל נוכחותם מגושמת של קטטר בחלל subdural מוגבל קשות בעכבר. יתר על כן, מסירה ארוכת טווח של תרופות שניתנו עקב קרישה תכופהשל כרוני מושתל צנתרים. לבסוף, תגובות חיסוניים נפוצות.

ניתן לעקוף בעיות אלה תוך שימוש בשיטה של הזרקת intrathecal האקוטית באמצעות מחט בהעדר קטטר preimplanted, המאפשר יישום מהיר ואנטומית מוגבל של תרופות וחומרים כימיים למייתרי השדרה בעכברים. שיטה זו שומרת באופן מלא את היתרונות של משלוח intrathecal על פני מסלולים אחרים מערכתיים משלוח (לדוגמא: דרך הפה, דרך הווריד, החדרה לקרום בטן, וכו ') כגון הספציפיות של אפנון בעמוד השדרה, המאפשר מינונים מופחתים ותופעות לוואי גבול, כמו גם יכולת לספק חומרים לא בדרך כלל לא חוצה את מחסום דם במוח מאז במהלך הזרקת intrathecal, המחט מוחדרת בין מאטר הדורה וחוט השדרה. חשוב לציין עם זאת, בהשוואה לשיטות אחרות של משלוח intrathecal, שיטת הזרקת מחט intrathecal היא פחות פולשנית, המאפשר יישומים רביםאותו בעל חיים מבלי לגרום כל נזק לרקמות משמעותיות או לעורר תגובה חיסונית עקב השתלה של חומר זר. עם זאת, זה דורש מיומנות טכנית למיקוד מדויק מאוד של המחט על מנת לאפשר יעילות.

הנה, אנחנו מבחינה ויזואלית להדגים את השיטה להשגת שיעור אופטימלי של הצלחה עבור במיוחד מיקוד בעמוד השדרה המותני. אתר הזרקה שנבחרה בניסוי הזה הוא החריץ בין L5 והעמודה L6 חוליות, סמוך למקום שבי חוט השדרה מסתיים, כדי למזער את האפשרות של פגיעה בעמוד השדרה. יתר על כן, אנחנו מדגימים את השימוש בטכניקה זו כדי להפיל גנים בחוט השדרה באמצעות siRNAs.

פרוטוקול

כל נהלי השימוש בבעלי החיים היו בהתאם לקווים מנחים אתיים שנקבעו על ידי גוף שלטוני המקומי (Regierungspräsidium קרלסרוהה, קרלסרוהה, גרמניה).

1. הכנת מורכבת siRNA / PEI

הפתרון המורכב siRNA / PEI מוכן באמצעות הוראות יצרן כדלקמן:

1. פתרון: לדלל את הכמות הרצויה של siRNA עם מים סטריליים (במידת צורך) עד רבע לסוף הנפח ולדלל עוד יותר את זה עם 10% פתרון גלוקוז עד מחצית מסוף הנפח. מערבולת בעדינות או מערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה. הכמות האופטימלית של siRNA צריכה להיקבע באופן אמפירי אבל 1 מיקרוגרם siRNA ב10 פתרון μl מורכב לכל בעל חיים הוא נקודת התחלה טובה לאופטימיזציה.
2. פתרון ב ': לדלל את הנפח הדרוש של מגיב PEI עם מים עד סטרילי כדי רבע מסוף הנפח ולדלל את זה עוד יותר עם 10% פתרון את הגלוקוז למחצית מסוף הנפח. ורטקס gently או מערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   הערה: הכמות של מגיב PEI קובעת את האיזון היוני במתחם, המשפיע על היעילות של transfection. כמו כן את הכמות האופטימלית של פתרון PEI צריכה להיקבע באופן אמפירי. בידיים שלנו, את הכמות האופטימלית היא 0.12 μl של פתרון PEI לכל מיקרוגרם siRNA 1.
3. מערבבים את הפתרון עם הפתרון B בבת אחת, מערבולת בעדינות.
4. דגירה הפתרון המשולב ל15 דקות ב RT לפני השימוש. קומפלקס זה הוא יציב לשעה 2 ב RT ול24 שעות ב 4 ° C.

2. הזרקת intrathecal

1. להרדים את העכבר עם isoflurane 3%, עד שהוא לא מראה סימנים של ליישר רפלקס. בנוסף, בדוק אם זנב ו / או רפלקס קמצוץ כפה על מנת להבטיח המצב של הרדמה נוספת.
2. לגלח סביב 2 סנטימטר ² של פרווה בקצה האחורי של החיה ליד בסיס הזנב כדי להקל על ויזואליזציה טובה יותר במהלך החדרת מחט.
3. מקם את עכבר בחרטומו לממשל isoflurane המשיך במהלך ההליך, להפחית isoflurane 1.5%, ולכסות את עיניו של העכבר עם חומר סיכה העין.
4. הכן את מוכן לשימוש פתרון מעורב siRNA באמצעות 25 μl המילטון מזרק המצורף ל30 G 0.5 במחט.
5. אתר את תהליך spinous של L6, שאמורה להיות הבולט אחד ולתקן את עמודת חוליות באזור זה על ידי לחיצה עליו בעדינות.
6. בזהירות להכניס את המחט בין החריץ של L5 וL6 חוליות ולבחון לקפיצי זנב כסימן זה מצביע על כניסה מוצלחת של המחט בחלל intradural.
   טיפ: השימוש בציפורן, אחד צריך להיות מסוגל לאתר את הגרוב גם כן.
7. ברגע שהינף זנב הוא ציין, באופן מיידי, אבל בזהירות, להבטיח את מיקום המחט ביד אחת ולהזריק את הנפח הרצוי של חומר ביד השנייה באיטיות.
   טיפ: נפח בין 5-10 μl הוא אופטימלי כנפח פחות מ 5 &181 #; l הוא לא אמין ונפח גדול יותר מ10 μl מוביל ליותר מדי לחץ.
8. ברגע שההזרקה מתבצעת, הזז את העכבר חזרה לכלוב להתאושש מהרדמה.
9. חזור על הפעולה הזרקה זה לפחות 2 יותר פעמים בכל שעה 24 להשיג downregulation האופטימלי של הגן הממוקד.

תוצאות

כדי להמחיש זריקה מוצלחת, ביצענו בטכניקה זו משתמשת בצבע מהיר גרין FCF בעכברי C57BL6 מבוגר (8-10 שבועות של גיל). בעלי החיים הורשו להתאושש במשך כמה דקות לאחר ההזרקה על מנת לספק מספיק זמן לצבע להתפשט ולאחר מכן נהרג עם מנת יתר של CO _2. בהמשך לכך, בעמודת החוליות הייתה גזור ואת חוט השדרה נחשף. Puncta הכחול תואם לצבע מתפזר, סימן את אתר ההזרקה. אין סימן לפגיעה בחוט השדרה ניתן הייתה לראות, המאשרת את הטבע פולשנית של טכניקה זו (איור 1 א). הצבע המוזרק מתפזר מא...

דיון

לכן, השיטה שתואר לעיל של זריקות מחט intrathecal היא יעילה, מהירה, במיוחד-מקומי, ולא הורסות. מבחינה טכנית, ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא נקודת החדרת מחט לתוך החריץ. זה חיוני כי הליך זה נעשה עם ידיים וסבלנות מאוד רגועות. כמו רבים הליכים כירורגיים, אימון משפר את קצב הזריקה מוצלחת. זה חשוב גם כי במהלך ניסוי בפועל, טכניקה זו אינה מספקת אינדיקציה ברורה על מנת לאשר באופן ישיר אם זריקה היא מוצלחת או לא. המחוון הגלוי רק של החדרת מחט הנכונה הוא קפיצי הזנב שהוא ציין כמו רפלקס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
In Vivo-jetPEI	Polyplus	201-10G
WAVE1 siRNA	סנטה קרוז	sc-36832
בקרה siRNA-A	סנטה קרוז	sc-37007
נוגדן אנטי-ß-טובולין III	סיגמא	T2200
נוגדן נגד WAVE1	R& D Systems	AF5514
צבע ירוק מהיר	Sigma	F-7252
איזופלורן	בקסטר
הגדרת איזופלורן	Drä ger Lü בק
מכונת גילוח	Wella
מזרק המילטון Gastight 1702	המילטון
30 גרם 1/2 ב-13 מ"מ מחט	BD Microlance	304000
מיקרוסקופ Leica MS5	Leica
פריימר קדימה WAVE1 עבור qRT-PCR	Sigma		cacagagcctcaggacagg
WAVE1 פריימר הפוך עבור qRT-PCR	Sigma		ctttttaccaacggcatctt
FastStart Essential DNA Green	Master Roche	6402712001