En protokoll er beskrevet som bruker anoksi / sult i C. elegans å modellere iskemi / reperfusjon. Funksjonelle utfall inkluderer økt dødelighet, synlige misdannelser i GFP-merket nevronale prosesser, og nedskrevne atferdsmessige reaksjoner som krever nervecellefunksjon.
Protokoller for anoksi / sult i de genetiske modellorganisme C. elegans simulere iskemi / reperfusjon. Worms separeres fra bakteriell mat og plassert under anoxia i 20 timer (simulert ischemi), og deretter flyttet til en normal atmosfære med mat (simulert reperfusjon). Denne eksperimentelle paradigme resulterer i økt død og neuronal skade, og teknikkene er presentert for å vurdere levedyktigheten til organisme, endringer i morfologien av berøring neuron prosesser, så vel som berøringsfølsomheten, som representerer de atferdsmessige utgangs av neuronal funksjon. Til slutt blir en fremgangsmåte for å konstruere hypoksiske inkubatorer ved hjelp av vanlig kjøkkenoppbevaringsbeholdere beskrevet. Tilsetningen av en massestrømningsstyreenhet tillater endringer som skal gjøres til gassblandingen i spesial inkubatorer, og et sirkulerende vannbad tillater både temperaturkontroll og gjør det lett å identifisere lekkasjer. Denne metoden gir et rimelig alternativ til kommersielttilgjengelige enheter.
C. elegans er en nematode som har vært i omfattende bruk som en flercellet eukaryote modellorganisme siden introduksjonen av Brenner en. Det er en billig, enkel og allsidig modell, som tillater enkel koblinger mellom genetiske forandringer og fenotypiske endringer to.
Iskemi er kjennetegnet ved en mangel på næringsstoffer og oksygen til et vev, etterfulgt av reperfusjon, når en serie av reaktive oksygenforbindelser fremstilles 3 og mesteparten av skaden oppstår. I 2002 ble en modell av ischemi / reperfusjon (IR) i C. elegans ble utviklet fire involverer sende hele ormen til anoksi, næringsmangel og varmestress for ca 20 timer etterfulgt av 24 timer under normale forhold. Selv om denne modellen er teknisk sett en anoksi-sult (AS) tilstand, oppstår celledød gjennom mekanismer som er konservert hos pattedyr, inkludert skade indusert av oksidanter under reperfusjon <sup>. 5 Videre, i likhet med pattedyr IR, skade indusert av AS i C. elegans kan forebygges ved iskemisk prekondisjonering 6,7 eller bedøvende prekondisjonering 8,9.
Protokollene nedenfor demonstrerer hvordan å etterligne IR i C. elegans bruker AS-modellen, hvordan å score morfologiske og atferdsmessige forandringer som følge av AS, og hvordan man skal tilpasse protokollen på en måte som gjør at forsøket skal gjennomføres med en lavere initiell investering ved hjelp av en skreddersydd, lett-bygget kammer alternativ .
AS har vært mye brukt i C. elegans å modellere IR skade. Noen sentrale punkter skal være uthevet for denne protokollen: C. elegans er resistente mot et bredt spekter av skader, begrunner behovet for 3 samtidige fornærmelser (varme, sult og anoksi) for å oppnå død ved hjelp av dette systemet. Anoksi alene ikke drepe ormene i dette vinduet for tiden 14. Videre er temperaturøkningen en ekstra belastning, så er det viktig å overvåke nøye. Strengt tatt ikke sult ikke bidra vesentlig til graden av dødelighet observert 7, per se, men det ser ut til å redusere variasjonen blant eksperimentelle replikater. Gitt at det kan være betydelig variasjon fra dag til dag, er det ekstremt viktig å sammenligne prøvene kjøres direkte i parallell, og å gjenta eksperimenter over flere dager. Generelt er resultatene målt for tre separate plater av 50-100 ormer / eksperimentell tilstand, og disse ern gjennomsnitt og anses som en enkelt eksperimentell replikere. Vanligvis mellom sju og ni gjentak ser ut til å være tilstrekkelig til å oppnå eller utelukke statistisk signifikans.
Utviklingsstadiet av ormer som brukes i forsøket må også være nøye overvåket som mottakelighet for ulike stadier til AS skader varierer betydelig 15,16. Bruken av unge voksne er standard, og larvestadiet (L3 og L4) ormer ser ut til å være mer motstandsdyktig mot de skadelige effektene av AS (upubliserte data).
Denne protokollen presenterer to måter å utføre eksperimenter, en ved hjelp av en lab-laget apparat (med Tupperware-type beholdere og gass innspill 11) og andre ved hjelp av en kommersiell hypoksisk kammer 4,6. Anoksi kan oppnås med andre midler som forbruker oksygen, som beskrevet andre steder 13,17. Bruken av alternative teknikker for å skape et hypoksisk miljø kan forandre AS inkubasjonstid nødvendigeå skape den ønskede mengden av død. Målretting ~ 20% overlevelse er et ideelt utgangspunkt for å studere vernetiltak, mens 80% er like ideelt for intervensjoner som forverre de skadelige effektene av AS. En annen viktig påminnelse er tidspunktet da observatør score døde / levende ormer. Hvis tiden for analysen er utvidet utover 24 timer, kan dataene være misvisende siden døde ormer blir stadig vanskeligere å identifisere. Dette kan være på grunn av snekkeskrotter blir forholdsvis transparent over tid, men også til det faktum at befruktede embryo kan utvikle seg til avkom post-mortem innsiden av skrotter og avbryte dem som de oppstår.
Analysen av neuronal morfologi kan bli endret for å se på protein uttrykk mønstre 18, atom fragmentering 4 og andre parametere 19 ved å erstatte en orm belastning som uttrykker den aktuelle genetisk kodet markør. En siste påminnelse er at visualisering avnevronale prosesser bør gjøres mindre enn 30 minutter etter å plassere ormer på lysbildet. Dyr holdt under anestesi på lysbilder for lengre perioder kan fremvise AS uavhengig skade. Justere mengden av dyr pr glide henhold til den tid som trenges for å spore og analysere dem.
The authors have nothing to disclose.
Tallene 1 og 2 ble tidligere publisert i Free Radical Biology & Medicine (Queliconi et al. 5) og har copyright holdt av Elsevier. Dette arbeidet ble støttet av den Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, den Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), og USPHS GM087483 (KN ). BBQ er en doktorgradsstudent som støttes av en FAPESP fellesskap.
N2 strain | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | Wild type strain | |
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons |
CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive |
Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3) | ||
Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |