Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun
Summary
Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.
Abstract
Afin de cibler une seule protéine à plusieurs organites intracellulaires, plantes généralement double emploi avec les gènes pertinents, et d'exprimer chaque gène séparément à l'aide des stratégies de réglementation complexes, y compris les promoteurs de différentiels et / ou des séquences de signaux. Ingénieurs métaboliques et les biologistes synthétiques intéressés à cibler les enzymes à un organite particulier sont confrontés à un défi: Pour une protéine qui doit être localisée à plus d'un organite, l'ingénieur doit cloner le gène même plusieurs fois. Ce travail présente une solution à cette stratégie: exploiter l'épissage alternatif de l'ARNm. Cette technique tire parti du chloroplaste établi et des séquences de ciblage de peroxysome et les combine en un seul ARNm qui est épissé de façon alternative. Certains variants d'épissage sont envoyés vers le chloroplaste, les uns pour le peroxysome, et certains au cytosol. Ici, le système est conçu pour les multiples ciblant un organite de l'épissage alternatif. Dans ce travail, la GFP a été prévu pour être exprEssed dans le chloroplaste, cytosol, et peroxysomes par une série d'conçus rationnellement 5 'de l'ARNm des tags. Ces balises ont le potentiel de réduire la quantité de clonage nécessaire lorsque des gènes hétérologues doivent être exprimés en plusieurs organites intracellulaires. Les constructions ont été conçues dans le travail précédent 11, et ont été clones en utilisant Gibson assemblage, un procédé de clonage indépendant de la ligature qui ne nécessite pas d'enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été introduits dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana avec un protocole Gene Gun modifié. Enfin, les feuilles transformées ont été observées par microscopie confocale.
Introduction
Ce travail est un projet d'ingénierie / de la biologie synthétique métabolique dans lequel les cellules végétales sont modifiées pour exprimer une protéine rapporteur dans plusieurs organites mais avec une seule construction d'ADN.
Une approche pour cibler des protéines à plus d'un emplacement de clonage implique de multiples copies génétiques, chacune contenant un peptide de localisation différente. Chaque copie doit être introduite par retransformation successifs, ou encore, par rétrocroisement transformations simples 1. Il s'agit de clonage supplémentaire, et est limitée par une balise de localisation par terminus.
Une autre façon de localiser une protéine à plusieurs endroits à travers l'épissage alternatif 2-5. ARN est transcrit à partir d'un seul gène, mais différentes copies de la transcription sont traitées différemment, souvent dans plus d'un titre par cellule. Cela peut entraîner plus d'un ARN messager dans la cellule transcrit à partir d'un gène unique. Ces différents messengeARN R peut coder pour différentes isoformes de la même protéine, ou dans le cas d'un décalage du cadre, une protéine différente. Bien que l'épissage alternatif ont été décrits dans la littérature depuis de nombreuses années, les mécanismes d'action et de donneur conservée et les sites d'épissage des récepteurs ne sont élucidés, plus récemment, 6. Comme ces sites sont mieux décrites, elles ouvrent des opportunités pour l'ingénierie.
ingénieurs métaboliques des plantes sont confrontés à un défi en exprimant une protéine dans plusieurs organites. Pour une protéine qui doit être localisée à plus d'un organite, le mécanicien doit cloner le gène même plusieurs fois, chacune avec une séquence signal séparé le diriger vers l'organite d'intérêt. Pour un gène unique en trois organelles, il s'agit simplement de trois gènes. Mais pour une voie métabolique six gène, cela élargit à 18 gènes, un effort significatif de clonage. Combinaison de plusieurs séquences de localisation en un seul signe de gène, alternativement épisséréduit ificantly cet effort. Par exemple, re-engineering photorespiration 7,8 et la synthèse des isoprénoïdes 9,10 implique à la fois les chloroplastes et les peroxysomes. Dans notre cas, nous avons profité de sites d'épissage comme observé dans un système naturel de Arabidopsis thaliana décrit précédemment 6. Nous rationnelle redessiné la séquence d'ARNm de quitter les sites d'épissage naturels seul, mais placés séquences qui coder chloroplastes ou des balises péroxisome ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). La protéine exprimée peut être ou ne pas avoir une étiquette, selon que le pré-ARNm codé qui a été excisé sous la forme d'un intron (figures 1g et 1h). Pour plus d'informations sur la conception des constructions présentées dans ce travail, s'il vous plaît voir l'article de compagnon 11.
Parce que c'est encore un effort significatif de clonage, assemblage Gibson, une nouvelle méthode de clonage des constructions d'ADN, est used dans la construction. Procédé Gibson peut être utilisée pour n'importe quelle séquence, indépendamment de sites de restriction (figure 2) de 12 à 14. La composition précise des enzymes permet en une seule étape, l'assemblage isotherme. Dans ce procédé, plusieurs parties linéaires à double brin d'ADN ont été conçus de telle sorte qu'ils ont des séquences chevauchantes de ~ 50 bp. L'ensemble de mélange d'enzymes Gibson digère partiellement les parties d'ADN linéaires, exposant simples brins de séquences homologues. Ces séquences simple brin partiels sont à nouveau recuit dans le mélange réactionnel, résultant en une seule étape, indépendante de la séquence, la réaction de ligature sous-clonage libre-rapide.
Ce travail décrit une) conception rationnelle constructions épissage alternatif pour l'expression dans les chloroplastes des plantes, les peroxysomes, et cytosols, 2) leur clonage en utilisant le nouveau procédé d'assemblage Gibson libre ligature, 3) leur livraison dans les cellules de la feuille de tabac avec le pistolet à gènes, et 4) des résultats montrant ciblage organite, comme observé avec la GFPet microscopie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, des stratégies simples sont décrits pour la localisation d'une seule protéine transgénique à plusieurs compartiments cellulaires chez les plantes. L'objectif était de concevoir construction qui exprimerait un seul gène dans plus d'un organite dans Nicotiana benthamiana. Les stratégies comprennent la conception rationnelle de constructions à base d'ADN GFP, assemblage Gibson, la livraison des plasmides aux cellules de la feuille avec le pistolet à gènes, et l'obs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Jen Sheen de l'Hôpital général du Massachusetts pour le généreux don de plants de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nous a beaucoup aidé dans le conseil en culture des plantes et la mise en place d'une zone de la chambre de croissance. Tom Ferrante de l'Institut Wyss a offert une aide cruciale à la microscopie confocale. Les auteurs tiennent tout particulièrement à remercier Don Ingber de l'Hôpital pour enfants de Boston et de l'Institut Wyss pour le don généreux d'un pistolet Gene et fournitures associées. Le financement de ce projet était prévu par un accord de coopération avec le ministère de l'Énergie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) pour PAS, JCW, et MdM, et par Chimerion Biotechnology, Inc. pour MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
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