Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun
Summary
Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.
Abstract
Om een enkel eiwit op meerdere subcellulaire organellen richten, planten typisch dupliceren de relevante genen, en een automatische elk gen afzonderlijk met behulp van complexe regulerende strategieën, inclusief differentiële promotors en / of signaal sequenties. Metabole ingenieurs en synthetische biologen vindt het richten enzymen een bepaalde organel staan voor een uitdaging voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd in meer dan een organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere keren. Dit werk brengt een oplossing voor deze strategie: evaluatie van alternatieve splitsing van mRNA. Deze technologie maakt gebruik van gevestigde chloroplast en peroxisoom targeting sequenties en combineert ze tot een enkel mRNA dat alternatieve wijze wordt gesplitst. Sommige splice varianten naar de chloroplast, wat het peroxisoom en genen tot het cytosol. Hier het systeem is ontworpen voor meerdere organel richt met alternatieve splicing. In dit werk werd GFP verwacht expr zijnEssed in de chloroplast, cytosol en peroxisomen door een reeks van rationeel ontworpen 5 'mRNA tags. Deze tags hebben het potentieel om de hoeveelheid klonen vereist wanneer heterologe genen moeten worden uitgedrukt in verschillende subcellulaire organellen verminderen. De constructen werden ontworpen eerder werk 11 en werden gekloneerd middels Gibson samenstel, een ligatie onafhankelijke klonen methode die restrictie-enzymen vereist. De resulterende plasmiden werden geïntroduceerd in Nicotiana benthamiana epidermale blad cellen met een gemodificeerd Gene Gun protocol. Tenslotte werden getransformeerd bladeren waargenomen met confocale microscopie.
Introduction
Dit werk is een metabole engineering / synthetische biologie project waarin plantencellen zijn ontworpen om een reporter eiwit tot expressie in meerdere organellen, maar met slechts een enkele DNA-construct.
Een benadering om eiwitten te richten op meerdere locaties omvat klonen meerdere genetische kopieën, die elk een andere lokalisatie peptide. Elk exemplaar moet worden ingevoerd door de opeenvolgende retransformation, of als alternatief, door terugkruisen enkele transformaties 1. Dit houdt extra klonen, en wordt beperkt door een lokalisatie tag per eindpunt.
Een andere manier om een proteïne te lokaliseren op meerdere locaties is door alternatieve splicing 2-5. RNA wordt getranscribeerd vanaf een enkel gen, maar verschillende exemplaren van het transcript verschillend verwerkt, vaak meer dan een manier per cel. Dit kan leiden tot meer dan een boodschapper-RNA in de cel getranscribeerd uit een gen. Deze verschillende messenger RNA kan coderen voor verschillende isovormen van hetzelfde eiwit of in het geval van een frameshift, een ander eiwit helemaal. Hoewel alternatieve splicing is in de literatuur beschreven voor vele jaren, de werkingsmechanismen en geconserveerde donor en receptor splice sites worden alleen wordt meer recent opgehelderd 6. Omdat deze sites worden beter beschreven, zij schept kansen voor engineering.
Plant metabole ingenieurs staan voor een uitdaging bij een eiwit tot expressie in meerdere organellen. Voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd meerdere organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere malen, elk met een aparte signaalsequentie richten aan het organel plaats. Voor een enkel gen in drie organellen, dit gewoon drie genen. Maar voor een zes-gen metabole route, dit uitgebreid tot 18 genen, een aanzienlijke inspanning klonen. Combineren van meerdere lokalisatie sequenties in een enkele, alternatief-gesplitste gen tekenificantly vermindert deze inspanning. Bijvoorbeeld, re-engineering fotorespiratie 7,8 en isoprenoide synthese 9,10 omvat zowel de chloroplasten en peroxisomen. In ons geval hebben we geprofiteerd van spliceplaatsen zoals waargenomen in een natuurlijke Arabidopsis thaliana systeem eerder beschreven 6. We rationeel herontworpen de mRNA-sequentie alleen achter de natuurlijke splitsingsplaatsen, maar geplaatst sequenties die chloroplast-of peroxisoom targeting markeringen zouden coderen in de alternatieve splicing introns (Figuur 1). Het tot expressie gebrachte eiwit kan al dan niet een label, naargelang de pre-mRNA dat gecodeerd werd uitgesneden als een intron (figuren 1g en 1h). Voor meer informatie over het ontwerp van de constructies die in dit werk, zie het begeleidend artikel 11.
Omdat dit nog steeds een aanzienlijke inspanning klonen, Gibson samenstel, een nieuwe methode voor het kloneren van DNA-constructen, is used in de bouw. De Gibson werkwijze kan worden gebruikt voor elke sequentie, ongeacht restrictieplaatsen (figuur 2) 12-14. De specifieke combinatie van enzymen maakt een stap isotherm montage. Bij deze werkwijze worden meerdere dubbelstrengs lineaire DNA delen, dat zij overlappende sequenties van ~ 50 bp gemaakt. De Gibson assemblage enzym mix gedeeltelijk verteert het lineair DNA delen, het blootstellen van enkele strengen van homologe sequenties. Deze gedeeltelijke enkelstrengs sequenties worden opnieuw gegloeid in het reactiemengsel, waardoor een snelle, een-stap sequentie-onafhankelijke ligatie vrij subklonering reactie.
Dit werk beschrijft 1) rationeel ontwerp alternatief verbonden constructen voor expressie in planten chloroplasten, peroxisomen, en cytosols, 2) hun klonen met behulp van de nieuwe-ligatie vrije methode van Gibson assemblage, 3) de levering ervan in tabaksbladeren cellen met de Gene Gun, en 4) resultaten tonen organel targeting, zoals waargenomen met GFPen confocale microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie worden eenvoudige strategieën beschreven voor het lokaliseren van een transgeen eiwit meerdere cellulaire compartimenten in planten. Het doel was construct dat een gen tot expressie zou meer dan een organel in Nicotiana benthamiana ontwerpen. Strategieën omvatten rationeel ontwerp van GFP-gebaseerde DNA-constructen, Gibson montage, levering van de plasmiden te bladcellen met de Gene Gun, en observatie van de resultaten met confocale microscopie.
Drie verschillende k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Jen Sheen van het Massachusetts General Hospital bedanken voor de gulle donatie van Nicotiana benthamiana zaailingen. Jen Bush hielp ons sterk in advies op het kweken van planten en het opzetten van een kweekkamer gebied. Tom Ferrante van de Wyss Institute aangeboden cruciale hulp bij confocale microscopie. De auteurs willen het vooral leuk om Don Ingber van Children's Hospital Boston en de Wyss Instituut voor de gulle donatie van een Gene Gun en bijbehorende supplies bedanken. De financiering voor dit project werd verstrekt door middel van een samenwerkingsovereenkomst met het ministerie van Energie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) voor PAS, JCW, en Dokters van de Wereld, en door Chimerion Biotechnology, Inc voor MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants – coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5′- and 3′-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5′ mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
