Imaging Gjennom pupal Case of<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Dette papiret demonstrerer anvendelse av en rask scanning konfokalmikroskop til bildecelle oppførsel direkte gjennom puparium. Ved å la pupal tilfelle intakt, gir denne metoden observasjon og måling av dynamiske celleprosesser på et stadium av Drosophila utvikling som er vanskelig å studere direkte.

Abstract

Den mangeårige bruk av Drosophila som en modell for celle-og utviklingsbiologi har gitt en rekke verktøy. Sammen har disse teknikkene aktivert analyse av celle-og utviklingsbiologi fra en rekke metodiske vinkler. Live-avbildning er en ny metode for å observere dynamiske celleprosesser, for eksempel celledeling eller cellemotilitet. Etter å ha isolert mutasjoner i uncharacterized antatte cellesyklusproteiner ble det viktig å observere mitose in situ ved hjelp av levende bilder. De fleste live-imaging studier i Drosophila har fokusert på de embryonale stadier som er tilgjengelig for manipulasjon og observasjon på grunn av sin lille størrelse og optisk klarhet. Men i disse fasene cellesyklus er uvanlig ved at den mangler en eller begge av de gap faser. Derimot, celler av pupal fløyen av Drosophila har en typisk cellesyklus og gjennomgår en periode med hurtig mitose som strekker seg over omtrent 20 timer for pupal utvikling. Det er lett å identify og isolere puppe av den aktuelle scenen for å fange mitose in situ. Montering intakt puppe gitt den beste kombinasjonen av tractability og holdbarhet under bildebehandling, slik at eksperimenter for å kjøre i flere timer med minimal innvirkning på celler og dyr levedyktighet. Metoden gjør det mulig observasjon av funksjoner så liten som, eller mindre enn, fly kromosomer. Justering av mikroskop innstillinger og detaljene for montering, tillates utvidelse av blandingen for å visualisere dynamikk membran av tilstøtende celler og fluorescensmerkede proteiner som tubulin. Denne metoden fungerer for alle testede fluorescerende proteiner og kan fange submikron skala funksjoner over en rekke tidsskalaer. Mens begrenset til den ytre 20 mikrometer til puppe med en konvensjonell konfokalmikroskop, kan denne metode for å observere protein og cellulære dynamikken i pupal vev in vivo være generelt nyttige ved studiet av cellen og utviklingsbiologi i disse vev.

Introduction

Eddik fly, Drosophila melanogaster, er en godt etablert modell for å studere mange aspekter av biologi. Drosophila forskning har en rik historie av genetisk eksperimentering som gjør at sofistikerte former for genmanipulering inkludert uttrykk, knockdown og mutasjon. Med bruk av fluorescerende protein etiketter, har dette repertoaret utvidet til å omfatte studier av celler og proteiner i levende dyr. Flua embryo er et utmerket system for slike studier som det er lite og optisk klart slik dyp, bildebehandling med høy oppløsning in vivo ^1-3. Andre stadier av fly utvikling har vist seg å være mindre medgjørlig, krever anestesi ^4, disseksjon og kort sikt kultur ^5,6, eller etablering av vinduer i hårstråene for bildebehandling ^7,8. Disse manipulasjoner vanligvis kompromiss dyr utvikling på lang sikt eller påvirke dyr på måter som begrenser bilde til korte perioder.

ent "> Å studere nye mutasjoner i gener som ligner cellesyklus regulatorer, var det viktig å finne en passende forberedelse til å studere timing og troskap av cellesyklusen. Siden de fleste embryonale cellesykluser avkortes (SM eller S-G2-M) og mutantene som undersøkes, ikke viser defekter før senere stadier, var det viktig å observere cellesyklus i pupal scenen vev. epitel-celler i puppe har en mer typisk G1-S-G2-M cellesyklus og pupper av dette stadiet er ikke i stand til muskelbevegelser ^ni. Den opprinnelige utgangspunktet for manipulasjoner inkludert intakt hele puppe uttrykker Histone2AV-GFP. tross for den tilsynelatende tetthet av pupal tilfelle, dette viste seg intakt forberedelse til å være utmerket for langsiktig in vivo imaging. Denne teknikken er enkel nok til at undergraduate forskere rutinemessig bruke den til å studere aspekter ved celle-og utviklingsbiologi i Drosophila og likevel oppløsningen er fin nok til å tillate diskriminering av mikrometer skala funksjoner. Med denne metoden, observasjoner av hendelser enn timer, minutter eller sekunder er mulig bare ved å justere tidsserier parametere. Videoer med blå, grønne, gule, oransje og røde fluorescerende proteiner, eller kombinasjoner av disse, er det gjort. Det blir fore hvis vekt på å minimalisere laserintensitet, selv langvarig avbildning har ingen effekt på utvikling eller levedyktigheten av dyrene.

Protocol

En. Fly Work Oppretthold fluer på standard cornmeal-agar-melasse-gjær medium ved romtemperatur 10. For kors, isolere jomfruer innen seks timer av eklosjonshormon. Etter å ha krysset til hanner av ønsket genotype, flyr endring til nye ampuller hver 3-4 dager. Merk: For disse eksperimentene, ble Gal4 linjen A9 brukes til å drive uttrykk for transgener i vingen. Fly aksjer kan fås fra aksjesenter i Bloomington. Aksjer som brukes i disse forsøkene ink…

Representative Results

Celler i pseudostratified epitel, slik som det fremkallende Drosophila øye, eller den ventrikulære lag av det fremkallende virveldyr sentralnervesystemet, gjennomgår atombevegelser, betegnet interkinetic atom migrasjon, i takt med cellesyklusen. DNA-replikasjon forekommer når kjerner er ved eller nær den nedre overflate og celler inn mitose når kjernen når den apikale overflate 15,16. Pupal vinge cellene danner et raskt dele monolayer epitel løpet av de første timene etter hode eversion. Dat…

Discussion

For å visualisere, måle, og kvantifisere funksjonene dele celler, kreves utvikling av en enkel forberedelse for å observere mitose i den levende pupal fløyen av Drosophila ved hjelp av confocal analyse av His2AvGFP uttrykke celler. Denne metoden ble brukt til å dokumentere at cellesyklusen i pupal fløyen bærer sterke likhetstrekk til cellesykluser i pseudostratified epithelia i at atomkjerner flytte til den apikale overflaten av epitel hvor de kommer inn mitose. Etter telophase, kjernene faller tilbake i…

Materials

Fly stuff fly pad	Genesee scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas south	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas south		CO2 regulator
Fly vials	Genesee scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine science tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular and subcellular features
Immersion oil (non fluorescent)
Stereo microscope	any		For fly manipulation