多剤耐性を実証<em>結核菌</em>増幅マイクロアレイ
Summary
増幅マイクロアレイは大幅にエンドユーザーのために、マイクロアレイのワークフローを合理化し、単一の室内に非対称PCR増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを兼ね備えています。マイクロアレイワークフローを簡略化する日常的低リソース環境において使用することができるマイクロアレイに基づく診断を作成するために必要な最初のステップである。
Abstract
マイクロアレイワークフローを簡略化する日常的低リソース環境において使用することができるMDR-TBマイクロアレイベースの診断を作成するために必要な最初のステップである。増幅マイクロアレイは単一の溶液中で、単一のマイクロ流体チャンバ内に非対称PCR増幅、目標サイズの選択、標的標識、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを組み合わせる。バッチ処理法は、9 -プレックス非対称マスターミックス及び多剤耐性結核菌 （MDR-TB）を遺伝子型決定するための低濃度のゲル素子マイクロアレイを用いて実証されている。ここで説明するプロトコルは、6時間で完了し、ゲノムDNAの少なくとも1,000細胞同等で正しい遺伝子型決定を提供することができる。オンチップの洗浄工程を組み込むことは完全に閉じアンプリコンの方法およびシステムになるであろう、実現可能である。増幅マイクロアレイでの多重化の程度は、最終的に単一のマスタmに組み合わせることができるプライマー対の数によって制約される九依然としてむしろアレイ上に固定化されるプローブの数よりも所望の感度および特異性のパフォーマンス·メトリックを達成する。同様に、総分析時間は、特定の使用目的に、研究課題、および検出の所望の限度に応じて短縮または延長することができる。それにもかかわらず、一般的なアプローチは、有意に手動集約的で時間のかかる処理工程の数を減らすことによって、エンドユーザーのためのマイクロアレイのワークフローを効率化し、日常的な臨床実践にマイクロアレイに基づく診断を翻訳するための簡略化された生化学的およびマイクロ流体経路を提供する。
Introduction
早期患者発見と迅速な治療が結核菌を減らす最も効果的な制御戦略（MTB）変速機1と見なされ、ポイントオブケア（POC）またはPOCテストの近くには、同時に結核を診断することを結核コミュニティの幅広い合意が今そこにあるアール薬剤耐性（DR）が必要である。例えばCepheid社のGeneXpertおよび他の核酸増幅試験などの技術は、多くのTB患者のための診断までの時間を短縮し、リファンピンまたは他の第一または第二選択薬2に対する耐性を付与する選択された変異に耐性を示す急速な読み出しを提供する。リアルタイムおよび等温核酸増幅試験は、MDR-TBをもたらす薬剤耐性突然変異を同定するために設計されているが、それらは検出突然変異のスペクトルは、患者の薬剤耐性プロファイルに対応する個別化された薬物療法を設計することがしばしば不十分であるおよび関連する技術的な制約光クロストークまたは増幅および報告化学の複雑さのために3-7座位または検出された変異の数を制限することがあります。したがって、より高い多重化容量を有する検出技術は、MDR-TBのPOC診断において公知のギャップに対処するために必要とされる。
マイクロアレイとWHOが承認しハインラインプローブアッセイは、MDR-TBの8月29日を診断する「複数の遺伝子、複数の変異「課題に対処することができます。残念ながら、これらのハイブリダイゼーションに基づく、多重化された検出プラットフォームは、多段階で複雑、かつ分子技術の大幅な訓練と技能を必要とするオープンアンプリコンプロトコルを使用しています。増幅マイクロアレイ30は 、これらのマイクロアレイワークフローと運用の問題の一部に対処するために設計されました。簡略化流体原理は、増幅ハイブリダイズし、単一のマイクロ流体チャンバ内での核酸標的を検出することである。ユーザーは、核酸増幅MASを紹介TERはピペットで流体室に混ぜて熱サイクルプロトコルを開始します。ここに示されているバッチ処理法では、マイクロアレイは、その後、バルク溶液中で洗浄し、乾燥させ、結像される。この研究は、 のrpoBのためのMDR-TBのマイクロアレイ試験（30の変異）、 のkatG（2の変異）、 仁荷 （4の変異）、 のrpsL（2の変異）、embB（1変異）、IS1245、IS6110を用いた増幅マイクロアレイの機能性を実証、および内部増幅およびハイブリダイゼーションコントロール。マイクロアレイプローブ（野生型（WT）及び一塩基変異体（MU））の少なくとも一つのマッチしたペアは、関心のある各変異のために含まれている。多剤耐性Mから精製された核酸結核は 、TDR結核菌株バンク31からのものである。他の箇所32記載のようにゲル素子マイクロアレイは、我々がpolymeriz各プローブ4％のモノマーおよび0.05mMを使用することを除いて、実質的に共重合させることによりガラス基板上に製造されるATION混合物。アレイは、使用前の50mlガスケットで囲まれている。熱サイクル、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の後、増幅マイクロアレイはAkonni携帯型分析に結像される。バックグラウンド補正、統合された信号強度は、生から得られる。tifの画像を、固定円アルゴリズムを使用して。各ゲル素子のノイズは、ローカルスポットのバックグラウンドの標準偏差の3倍として計算される。対雑音比（SNR）、信号用の≥3が値遺伝子標的は、典型的には、検出と見なされる。各遺伝子または特定のコドンにおける変異の有無を決定するために、判別比は、（WT-MU）/（WT + MU）としてSNR値から計算される。 0野生型配列の指標である判別比<比は、一方0は、遺伝子座における薬剤耐性変異の指標である>は。
Protocol
Representative Results
Discussion
増幅マイクロアレイとの多重化の程度は、最終的には、マルチプレックス非対称PCRの効率ではなく、マイクロアレイによって決定される。我々の経験では、一意の10〜12のプライマー対を容易に増幅マイクロアレイフォーマットで多重化することができる。従来のプライマーおよびプローブの設計基準のでその一つはこれもPCR緩衝液中の溶液相核酸および固定化されたマイクロアレイプローブ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、付与RC3のAI089106の下で国立衛生研究所（NIH）によってサポートされていました。
多剤耐性結核核酸は、熱帯病研究訓練のための国連児童基金/国連開発計画/世界銀行/世界保健機関特別プログラム（TDR）、ジュネーブ、スイスから提供された。
我々は、プロトタイプアッセイに含める特定の遺伝子突然変異についてのガイダンスのために米国疾病対策予防センターの博士トムShinnickに感謝します。
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
