Summary
Un microréseau d'amplification asymétrique combine l'amplification par PCR et l'hybridation microarray dans une seule chambre, qui simplifie considérablement microarray flux de travail pour l'utilisateur final. Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de diagnostics des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources.
Abstract
Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de MDR-TB diagnostic des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources. Un microréseau d'amplification combine amplification PCR asymétrique, la sélection de la taille de la cible, l'étiquetage cible, et microarray hybridation dans une solution unique et dans une seule chambre microfluidique. Une méthode de traitement par lots est démontrée avec un mélange maître asymétrique 9 complexes et à faible densité élément de gel pour le génotypage microréseau multi-drogue Mycobacterium tuberculosis résistantes (MDR-TB). Le protocole décrit ici peut être complété en 6 heures et fournir correct génotypage d'au moins 1 000 équivalents cellulaires d'ADN génomique. L'intégration sur puce des étapes de lavage est possible, qui se traduira par une méthode d'amplicon entièrement clos et système. L'étendue de multiplexage avec un microréseau d'amplification est finalement limitée par le nombre de paires d'amorces qui peuvent être combinés en un seul maître mix et encore obtenir une sensibilité désirée et des mesures de performance de spécificité, plutôt que le nombre de sondes qui sont immobilisées sur la matrice. De même, le temps total d'analyse peut être raccourcie ou allongée en fonction de l'utilisation spécifique prévue, question de recherche, et les limites souhaitées de détection. Néanmoins, l'approche générale simplifie considérablement microarray flux de travail pour l'utilisateur final en réduisant le nombre d'étapes manuellement intensives et longues traitement, et fournit une voie biochimique et microfluidique simplifiée pour traduire diagnostic des biopuces dans la pratique clinique de routine.
Introduction
La détection précoce des cas et un traitement rapide sont considérés comme des stratégies de lutte les plus efficaces pour réduire Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmission 1, et il est maintenant un large consensus dans la communauté de la tuberculose que d'un point de service (PDS) ou près de test de POC pour diagnostiquer simultanément la tuberculose et la résistance aux médicaments (DR) est nécessaire. Les technologies telles que GeneXpert de Cepheid et autres tests d'amplification des acides nucléiques de réduire le temps de diagnostic pour de nombreux patients atteints de tuberculose, et fournissent une lecture rapide indique la résistance à la rifampicine ou mutations sélectionnées conférant une résistance à d'autres médicaments de première ou deuxième ligne 2. Bien que les tests d'amplification en temps réel et de l'acide nucléique isotherme sont conçus pour identifier les mutations de résistance aux médicaments qui mènent à la TB-MR, le spectre des mutations qu'ils détectent est souvent insuffisante pour concevoir un schéma thérapeutique individualisé correspondant au profil de résistance aux médicaments du patient, et les contraintes techniques liéesà la diaphonie optique ou de la complexité de l'amplification et de reporting chimiques 3 au 7 mai limiter le nombre de loci ou des mutations qui sont détectés. Ainsi, les technologies de détection avec une capacité de multiplexage élevé sont nécessaires pour combler les lacunes connues dans le diagnostic de TB-MR au PS.
Les puces à ADN et les Hain essais de sonde de la ligne approuvée par l'OMS peuvent répondre à la «gène multiple, multiples mutations" défi de diagnostiquer la TB-MR 8-29. Malheureusement, ces plates-formes, de détection multiplex à base d'hybridation utilisent plusieurs étapes, compliqué, et les protocoles ouverts amplicon qui exigent une formation importante et la maîtrise des techniques moléculaires. L'amplification microréseau 30 a été conçu pour répondre à certaines de ces puces à ADN flux de travail et des problèmes opérationnels. Les principes fluidiques sont simplificatrices pour amplifier, s'hybrident, et détecter des cibles d'acides nucléiques dans une seule chambre microfluidique. L'utilisateur introduit les acides nucléiques et d'amplification master mélanger dans une chambre fluidique avec une pipette et commence le protocole de cycle thermique. Pour la méthode de traitement par lots représenté ici, les microréseaux sont ensuite lavées dans une solution en vrac, séchées et imagés. Cette étude démontre la fonctionnalité d'un microréseau d'amplification à l'aide d'un test de TB-MR microarray pour rpoB (30 mutations), katG (2 mutations), inhA (4 mutations), rpsL (2 mutations), embB (1 mutation), IS1245, IS6110 , et une amplification interne et de contrôle de l'hybridation. Au moins une paire appariée de microréseau de sondes (type sauvage (WT) et mutantes de nucléotide unique (MU)) est inclus pour chaque mutation d'intérêt. Acides nucléiques purifiés à partir de multi-drogue M. résistant la tuberculose sont de la souche TDR tuberculose 31 Banque. puces d'éléments de gel sont fabriqués sur des substrats de verre par copolymérisation essentiellement comme décrit par ailleurs 32, sauf que nous utilisons 4% de monomère et 0,05 mM chaque sonde dans le polymérisablesmélange d'ation. Les tableaux sont entourés d'un joint de 50 ml avant l'utilisation. Après cyclage thermique, hybridation et lavage étapes, les puces d'amplification sont visualisés sur un analyseur portable Akonni. Fond corrigée, les intensités de signaux intégrés sont obtenus à partir de la première. Images tif en utilisant un algorithme de cercle fixe. Bruit pour chaque élément en gel est égale à trois fois l'écart type des milieux de tache locales. cibles de gènes sont généralement considérés comme détectable pour le rapport signal sur bruit (SNR) des valeurs ≥ 3. Afin de déterminer la présence ou l'absence d'une mutation spécifique dans chaque gène ou codon, un rapport discriminant est calculée à partir des valeurs de SNR que (WT-MU) / (WT + MU). Ratios discriminants <0 sont indicatifs d'une mutation de résistance aux médicaments au niveau du locus, tandis que les ratios> 0 sont indicatifs de la séquence de type sauvage.
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Protocol
Pour les laboratoires qui suivent les consignes de PCR universelle, il est opérationnel plus efficace d'inclure plusieurs puces d'amplification et joints par substrat et laver tous les puces d'amplification simultanément dans un conteneur, comme décrit ici. Formats consommables sont disponibles pour effectuer des post-amplification microarray étapes de lavage dans un test d'amplicon fermée entièrement scellé, comme rapporté ailleurs 30,33.
1. Configuration
- Extraire et de purifier des acides nucléiques à partir de l'échantillon dans des conditions de sécurité biologique appropriées avec une méthode de choix. L'exigence est que les acides nucléiques être d'une pureté suffisante pour asymétrique amplification, PCR multiplex.
- Préparer l'espace de travail en essuyant les surfaces et l'équipement avec des solutions de décontamination.
- Placer les réactifs d'amplification sur la glace ou bloc froid.
- Etiqueter un tube de 1,5 ml centrifuger stérile pour le mélange maître d'amplification, et étiqueter un stérile de 0,2 ml centrifuger tusoit pour chaque échantillon.
- Après réactifs sont décongelées, vortex brièvement et de recueillir le contenu au fond du tube avec une impulsion de spin dans une mini-centrifugeuse. Ne pas vortex la Taq polymérase. Tapotez doucement le tube pour mélanger et de suivre avec une impulsion de spin dans la mini-centrifugeuse.
- Préparer un mélange maître d'amplification en utilisant les volumes par-échantillon réactionnelles indiquées dans le tableau 1. Afin de tenir compte des imprécisions possibles de pipetage, préparer au moins un volume de réaction de plus que le nombre total d'échantillons en cours de traitement. Notez que le mélange maître contient plus Taq polymérase, au-delà de ce qui est prévu avec le tampon muliplex PCR. Seulement ajouter le contrôle d'amplification / d'inhibition au mélange maître après tous les autres réactifs sont combinés, et les tubes stock réactifs renvoyée au stockage.
| Réactif | Volume par-échantillon (pl) | <strong> Finale [] |
| PCR Buffer Mulitplex avec HotStar Taq plus | 25 | 1x |
| albumine de sérum bovin (BSA) | 0,55 | 0,6 mg / ml |
| Formamide | 3.8 | 7,6% |
| Taq polymérase supplémentaires | 0,8 | unités / pl (4 unités au total) |
| MDR-TB mélange d'amorces | 15.75 | - |
| RNase-H 2 O | 2.1 | - |
| Amplification / Contrôle inhibition | 1 | 5.0 fg / pl |
| Total | 49 |
La composition du mélange tableau 1. MDR-TB amplification microarray maître.
- Vortex le mélange maître et de recueillir le contenu au fond du tube avec une impulsion de spin dans une mini-centrifugeuse.
- Mélanger 49 pi de mélange maître et 1 pl de M. ADN de la tuberculose à chacun des tubes échantillons issus de l'étape 1.4 ci-dessus. Pour une externe, pas de contrôle de modèle (NTC), utiliser une pi d'eau moléculaire de qualité de biologie à la place de la M. tuberculose échantillon d'ADN. Vortex et impulsion de spin tube (s) lorsque vous avez terminé.
2. Chargez amplification puces à ADN
- Ajouter 48 ul de chaque Master Mix / échantillon sur le centre de leurs puces respectives, en faisant attention de ne pas toucher la puce elle-même.
- Placez une lamelle sur le dessus de la garniture de puces à ADN et le joint, en faisant attention à ne pas coincer les bulles d'air dans la chambre de puces à ADN. Des bulles d'air peuvent affecter négativement l'efficacité d'amplificationet peut créer des artefacts ou de bruit dans l'image de puces à ADN ultérieure.
3. Cycle thermique
- Une fois toutes les puces sont chargés de l'échantillon, le lieu substrats sur le cycleur thermique de bloc plat. Assurez-vous que l'option chauffée de couvercle est en position "Off". Équipement obtenu de Akonni Biosystems sera déjà préqualifiés pour utilisation. Sinon, il est très important de vérifier que le cycleur thermique de bloc plat (s) donne (nt) uniforme, chauffage uniforme dans tous les supports de puces à ADN.
- Ouvrez le logiciel de cycleur thermique, sélectionnez le programme approprié, entrez "50 pl" pour le volume de réaction, et de lancer la course. Le protocole de cyclage thermique décrit ici se compose de:
Thermiques étapes à vélo 1 88 ° C 5 min 2 88 ° C 30 sec 3 55 ° C 1 min 4 65 ° C 30 sec 5 Répétez les étapes (2-4) pendant 50 cycles 6 65 ° C 3 min 7 55 ° C 3 heures - Le nombre total de cycles thermiques et 55 ° C l'après-amplification temps d'attente sont des variables indépendantes que l'utilisateur peut modifier, si nécessaire ou approprié pour l'expérience spécifique. Parce que le mélange maître TB-MR crée asymétriques amplicons (principalement simple brin), il est généralement utile d'inclure des cycles thermiques plus que, autrement, pourraient être utilisés pour un protocole d'amplification exponentielle classique, PCR.
- Lorsque le programme de cyclisme et l'hybridation thermique est terminée, la fin du programme, retirez les puces d'amplification, fermez le logiciel, et éteignez le cycleur (s) thermique.
4. Laver et sécher
- Pour le lavage jusqu'à 24 substrats simultanément, préparer au moins 250 ml 1x SSPE - 0,1% de Triton X-100 du tampon de lavage, et deux conteneurs avec au moins 250 ml d'eau désionisée ou de qualité Milli-Q chacun. Le tampon de lavage peut être préparé à l'avance.
- Retirez délicatement la lamelle et le joint de chaque chambre de microréseau d'amplification en utilisant une pince plate-end. Cette étape est le moment où il est le plus grand risque de causer de blessures réseaux d'éléments de gel. Utiliser les contrôles de contamination PCR appropriées pour prévenir la propagation des acides nucléiques amplifiés à l'intérieur de l'environnement de travail.
- Placez substrats de puces à ADN dans un support histologie de diapositives, et placer toutes les diapositives dans le bac de lavage contenant le tampon de lavage. Couvrir le récipient avec un couvercle.
- Laver microarrays pendant 10 min à température ambiante avec agitation douce.
- Tremper les puces trois fois dans chacune des deux lavages successifs de déminéralisée ouEau de qualité Milli-Q, et l'air sec.
5. Imaging
Le mélange d'amorces asymétrique MDR-TB génère amplicons Cy3 marqués. puces d'éléments de gel peuvent être visualisés avec n'importe quel imageur microarray norme capable de l'imagerie Cy3. La procédure d'imagerie suivante est spécifique pour le mélange maître TB-MR, domaine Dx2100 imageur portable et un logiciel d'analyse automatisée fournie par Akonni.
- Assurez-vous que le câble Ethernet de l'imageur est connecté à l'ordinateur.
- Tournez sur l'imageur. L'interrupteur d'alimentation est situé sur le panneau arrière de l'instrument. La LED bleue sur le devant de la caméra s'allume lorsque imageur est sous tension.
- Allumez l'ordinateur.
- Sur le bureau de l'ordinateur, double-cliquez sur l'icône du logiciel pour lancer le logiciel d'analyse d'image automatisée.
- Attendez que le logiciel pour établir une connexion avec l'appareil photo de l'imageur. Une fois la connexion établie, le bouton Analyser devient disponible, et lamessage «Connexion réussie» apparaît dans le coin inférieur gauche de l'écran.
- Insérer la puce d'amplification séché avec le microréseau opposé à l'utilisateur, et en direction de la lentille d'objectif. Si la puce n'est pas correctement orientée par rapport à la lentille et de la caméra, le logiciel d'analyse automatisé échoue à placer une grille sur l'image de fluorescence.
- Fermez la porte d'accès. Un aperçu sera disponible sur l'écran d'ordinateur.
- Sélectionnez le script d'analyse de TB-MR dans le menu déroulant et entrez le temps de l'exposition souhaitée (en millisecondes). Un point de départ typique pour élément de gel puces d'amplification est 100-500 ms.
- Pixels saturés seront affichés sur l'image de prévisualisation en rouge. Ajuster le temps d'exposition afin de minimiser le nombre de pixels à l'intérieur de spots saturés individuels.
- Cliquer Analyser à acquérir et à analyser l'image de fluorescence. Le logiciel placera automatiquement uneMDR-TB réseau spécifique au test sur l'image, extraire intensité intégrée et des valeurs de fond, et de faire rapport résistance aux médicaments et de génotypage des résultats. L'analyse automatique prend généralement quelques secondes. Pour les images difficiles qui contiennent des rayures, de la poussière, des objets fluorescents ou des dommages physiques aux caractéristiques de puces à ADN, le logiciel peut nécessiter jusqu'à 1 min pour compléter l'analyse.
- Une fois l'analyse terminée, cliquez sur Enregistrer, sélectionnez le dossier de destination, tapez un nom de fichier, et cliquez sur OK. Données de biopuces sous-jacents sont enregistrées dans un fichier xls. Et peuvent être exportés pour des analyses hors ligne, si désiré.
- Une fois l'analyse terminée, retirez la puce d'amplification de l'imageur, et cliquez sur Nouveau pour lancer l'analyse suivante.
- Lorsque vous avez terminé la collecte de données, fermez le logiciel, éteignez l'ordinateur, et d'éteindre la caméra.
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Representative Results
Analyse d'image qualitative peut donner un aperçu des sources de bruit ou de la variabilité expérimentale qui sont difficile à identifier dans les tableaux de données générés par un logiciel automatisé d'analyse d'image. Ainsi, il peut être utile de visuellement s'assurer que 1) tous les éléments de gel sont intacts et en bon état, 2) le contexte mondial est sans artefacts fluorescents qui pourraient affecter signal individuel de bruit SNR) de valeurs (3) il n'existe aucune preuve pour la formation de bulles ou non uniforme amplification / hybridation à travers le réseau, et 4) que le logiciel a correctement identifié tous les points sur l'image de puces à ADN. Exemple de MDR-TB images amplification de puces à ADN sont présentés dans la figure 1, illustrant un tableau et des objets qui peuvent survenir en raison de dommages physiques ou de bulles pendant le cycle thermique de haute qualité. Standard des logiciels d'analyse d'image de puces à ADN est généralement en mesure de placer une grille et extraire intensité intégrale et données de base même à partir d'images de mauvaise qualité comme shpropre à la figure 1B, il incombe au chercheur d'établir des critères et des mesures de contrôle de la qualité pour accepter ou rejeter les images de puces à ADN de l'analyse. redondance de la sonde peut aider à améliorer ces questions. Cependant, une TB-MR algorithme de rapports amplification de puces à ADN de diagnostic entièrement automatisé serait autrement déclarer le test de la figure 1B comme «invalide».
Des valeurs de SNR de puces à ADN pour l'amplification d'une série de dilutions de l'ADN génomique de type sauvage de H37Ra sont présentés dans le tableau 2. Lors de 6,25 pg d'ADN génomique entrée par réaction ou d'environ 1,25 x 10 3 équivalents de cellules, toutes les sondes de type sauvage sont facilement détectés. les valeurs de SNR pour chaque amplification des contrôles internes et d'inhibition allaient de 98,48 (rpoB) à 967,24 (Akonni fournies contrôle positif interne), ce qui indique que tous les gènes cibles dans la réaction d'amplification multiplex asymétrique sont amplifiés et détectable. Aucunles contrôles de modèle ont été négatifs (SNR <3) pour toutes les sondes dans la puce d'amplification. ratios de génotypage à ADN d'entrée de 6,25 pg variaient de 0,18 à 1,00 pour toutes les paires de sondes WT / MU, ce qui démontre un comportement correct de WT et MU sondes et génotypage approprié.
Données de génotypage représentatifs pour un groupe d'isolats de référence de l'Organisation mondiale de la Santé de génotype connu sont présentés dans le tableau 3. Si un polymorphisme de nucléotide simple (SNP) est représenté sur l'élément de gel microréseaux, le test d'amplification des microréseaux détecte avec précision la mutation correspondante dans le MDR -TB génome. Certains des sondes de microréseaux d'amplification sont également sensibles aux mutations proches voisins qui ne sont pas représentés explicitement sur le tableau comme une sonde unique. Par exemple, isoler TDR-0129 contient une mutation S531E dans le gène rpoB, mais il n'y a pas une sonde spécifique sur le microréseau d'amplification pour S531E. Néanmoins, les cinq autres sondes de SNP Targreting codon 531 indiquent qu'une mutation est présente au niveau du codon 531 - la puce d'amplification indique donc à juste titre que cet isolat est résistant à la rifampicine. Sensibilité similaire à la mutation rpoB S513W est évident pour l'isoler TDR-0148. D'autre part, certaines sondes SNP ne sont pas sensibles à des mutations de voisins proches, comme illustré par isolat TDR-0148 et la mutation rpoB S512G, et isolent TDR-0011 et la mutation katG S315R. Nous pensons que ce type de comportement de la sonde est une conséquence de la structure secondaire et tertiaire dans l'amplicon et / ou de la sonde 34 simple brin, et n'est pas quelque chose qui peut être prédite a priori. Néanmoins, sonde sensibilité aux mutations voisins proches est analogue à l'utilisation de balises moléculaires bâclée de détecter de multiples mutations de résistance aux médicaments avec un ensemble minimal de PCR en temps réel sonde 35.36, et peut être diagnostique avantageux à condition que le test ne génère pas de faux positifs relationstive à la sensibilité aux médicaments phénotypique.
Figure 1. (A) l'image de puces à ADN Exemple d'amplification pour 100 pg de type sauvage M. tuberculosis H37Ra ADN génomique et une fois 100 d'exposition msec. balises Cy3 (par maillage automatique et un logiciel de segmentation) sont sur la périphérie de l'image. (B) l'image d'un microréseau d'amplification montrant un artefact de halo fluorescent résultant de la formation de bulles au cours du cyclage thermique, et endommagé des éléments de gel / débris. Logiciel d'analyse d'image automatique est encore capable de placer une grille et d'extraire des données à partir de cette image. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Entreprise | Numéro de catalogue |
| Akonni Biosystems | Renseigner |
| Qiagen | # 206143 |
| Qiagen | # 201207 |
| Qiagen | # 206143 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP227-500 |
| Sigma-Aldrich | # 3B6917 |
| Akonni Biosystems | Renseigner |
| Akonni Biosystems | Renseigner |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP1328-4 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP151-500 |
| Current Technologies, Inc. | # BRSPRAY128 |
| Decon Labs, Inc. | # 8416 |
| Entreprise | Numéro de catalogue |
| Akonni Biosystems | 100-20011 |
| 100-10021 | |
| Arrayit | HTW |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # 10-300 |
| VWR | # 3365040 |
| VWR | # 93000-196 |
| Pneumatique centrale | # 95630 |
Tableau 2. Matériaux et équipement requis.
| Codon | Sonde ID | WT sonde SNR valeurs | 500 pg | 100 pg | 50 pg | 25 pg | 12,5 pg | 6,25 pg | |||||||
| rpoB | 507 | 1 | 900,22 | 644,46 | 523,17 | 431,08 | 364,49 | 287,47 | |||||||
| 3 | 1016,37 | 699,38 | 600,16 | 525,07 | 446,51 | 361,64 | |||||||||
| 511 | 5 | 867,67 | 611,97 | 529,90 | 451,73 | 403,76 | 307,68 | ||||||||
| 512 | 8 | 810,69 | 544,04 | 488,85 | 436,89 | 391,62 | 257,46 d> | ||||||||
| 513 | 11 | 824,36 | 547,04 | 496.00 | 472,01 | 408,96 | 242.25 | ||||||||
| 515 | 15 | 715,48 | 536,59 | 416,96 | 335,81 | 267,48 | 189.10 | ||||||||
| 516 | 17 | 723,83 | 496,44 | 402,95 | 69 "> 329,09270.10 | 201,98 | |||||||||
| 522 | 27 | 674,37 | 413.33 | 360,40 | 316,75 | 236,19 | 153.40 | ||||||||
| 524 | 29 | 269,46 | 153.69 | 117.71 | 118.02 | 110.13 | 51.22 | ||||||||
| 526 | 31 | 136.37 | <td class = "xl69"> 109.9082.63 | 76.76 | 53.61 | 37.76 | |||||||||
| 531 | 44 | 219,92 | 136.31 | 109.16 | 96.18 | 80.58 | 26.44 | ||||||||
| 533 | 51 | 130.54 | 83.60 | 76.03 | 63.47 | 61.35 | 41.54 | ||||||||
| rpsL | = "Xl71"> 43 | 54 | 10.41 | 12.75 | 53.30 | 767,18 | 5.39 | 362,42 | |||||||
| 88 | 56 | 655,54 | 542,79 | 527,43 | 690,34 | 403,86 | 456,05 | ||||||||
| katG | 315 | 58 | 1037,03 | 873,46 | p: none "> 816,64974,83 | 811,79 | 876,47 | ||||||||
| embB | 306 | 66 | 940,81 | 781,13 | 788,75 | 837,65 | 787,05 | 696,69 | |||||||
| inhA | 8 | 82 | 1069,43 | 934,38 | 862,58 | 936,88 | 809,85 | 682 0,56 | |||||||
| 15 | 85 | 1111,66 | 931,88 | 918,22 | 957,87 | 795,72 | 723.16 | ||||||||
| 17 | 87 | 1114,49 | 926,03 | 920,60 | 970,70 | 854,15 | 744,41 | ||||||||
Tableau 3. Rapports signal à bruit pour les sondes de type sauvage et une série de dilutions de M. valeurs de SNR tuberculose H37Ra ADN génomique.> 3 sont considérés comme détectable.
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Tableau 4. Des données de génotypage représentatifs de multirésistance de génotype connu à 25 pg par réaction en micro d'amplification. Astérisques identifient des mutations qui ne sont pas représentés par une sonde unique sur l'élément microréseau de gel. WT = séquence d'acide nucléique de type sauvage. Les valeurs négatives (gras et ombragés) sont révélateurs d'une mutation, la résistance aux médicaments donc phénotypique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'étendue de multiplexage avec un microréseau d'amplification est finalement dictée par l'efficacité de la PCR multiplex asymétrique, et non le microréseau. Dans notre expérience, 10-12 paires d'amorces uniques peuvent être facilement multiplexés dans un format amplification de puces à ADN. Critères d'amorces et de conception de la sonde classiques s'appliquent donc à de nouveaux essais, à l'exception que l'on doit aussi tenir compte des interactions potentielles entre les acides nucléiques en phase soluble et des sondes de microréseaux immobilisés, l'efficacité thermique du thermocycleur et le comportement sonde d'hybridation dans un tampon PCR qui a également contient des amorces de PCR et de faible poids moléculaire artefacts poids d'amplification. Approches d'amplification hautement multiplexées telles que l'amplification du génome entier ne sont pas propices à une seule chambre protocole amplification de puces à ADN pour un certain nombre de raisons techniques, y compris les interférences entre les hexamères aléatoires et sondes immobilisées, et l'hybridation inefficace, amplicons double brin long. Làest également une inter-relation entre la facilité d'utilisation, le temps total d'analyse, et des limites de détection que les utilisateurs individuels devront tenir compte lors de la conception des essais personnalisés ou en utilisant le test de TB-MR décrit ici. Par exemple, la réduction du nombre de cycles d'amplification, voire d'éliminer l'étape d'hybridation de post-amplification réduira considérablement le temps d'analyse totale, mais au détriment de la sensibilité du test. D'autre part, la réalisation d'une limite de détection de 10 copies du gène reproductible peut nécessiter plusieurs cycles d'amplification ou le temps d'hybridation, ce qui prolonge le temps total d'analyse au-delà d'un seul poste de travail.
Les gènes, les mutations, imageur, un logiciel d'analyse et de rapports algorithme décrit ici sont illustratifs de la méthode et un système d'amplification microréseau, plutôt que d'un rapport sur leur performance analytique et l'utilité clinique. Par exemple, l'échantillon de départ peut être crachats, sédiments décontaminés, cultures solides-liquides ou - l'exigencepour la puce d'amplification est simplement que les acides nucléiques extraits sont amplifiable par asymétrique, la PCR multiplexe. Certains chercheurs ou cliniciens peuvent trouver peu ou pas de valeur clinique dans la détection rpsL ou mutations embB qui confèrent une résistance à la streptomycine et l'éthambutol, respectivement, que la résistance à la rifampicine et à l'isoniazide définir la TB-MR. Ainsi, ces amorces de PCR et des sondes de puces à ADN peuvent être remplacés par des amorces et des sondes qui ciblent les gènes et les mutations conférant une résistance à d'autres premier ou deuxième ligne d'antibiotiques. Il est possible d'écrire un algorithme de rapports à fournir à l'utilisateur des informations détaillées sur les mutations spécifiques qui sont détectés dans un échantillon donné, plutôt que d'une "résistance détectée« simple ou «résistance non détecté" résultat. Pour les chercheurs qui s'intéressent à l'utilisation de ce test spécifique pour analyser M. tuberculose isolats, il est également possible de fournir les données de génotypage, même si l'élément IS6110 n'est pas detected dans l'échantillon.
Indépendamment de l'analyse et de reporting permutations possibles, la puce d'amplification et protocole décrit ici est conçu pour simplifier considérablement microarray flux de travail en combinant plusieurs étapes de biologie moléculaire dans une réaction biochimique unique et chambre microfluidique. Les données représentatives démontrent l'efficacité de l'approche en amplifiant neuf régions génomiques de MDR-TB et la détection de ces amplicons asymétriques avec une faible densité élément de gel microarray. Le protocole décrit ici utilise un procédé de lavage en vrac qui oblige l'utilisateur à supprimer physiquement le joint et lamelle de l'amplification microarray avant le lavage, et est donc plus approprié pour la recherche-utilisation uniquement applications plutôt que les diagnostics cliniques. Comme décrit par ailleurs, cependant, il est certainement possible d'incorporer une étape de lavage sur puce utilisant fluidique flux latéral 33 et donc conserver un consommable amplicon entièrement clos, y comprisCOMPRIS qui peut être facilement intégré dans un système de diagnostic échantillon en réponse-out qui est approprié pour des applications de point de soins.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) sous subvention RC3 AI089106.
Acides nucléiques de MDR-TB ont été fournis par le Fonds / développement des Nations Unies Programme / Banque mondiale / Organisation mondiale de la Santé Programme spécial des Nations Unies pour l'enfance pour la recherche et la formation concernant les maladies tropicales (TDR), Genève, Suisse.
Nous remercions le Dr Tom Shinnick des US Centers for Disease Control and Prevention des indications sur les gènes et les mutations spécifiques à inclure dans le test de prototype.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al.
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H.
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J.
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
