Folding og karakterisering av en Bio-responsive Robot fra DNA Origami

Summary

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Abstract

DNA nanorobot er en hul sekskantet nanometric enhet, designet for å åpne i respons til bestemte stimuli og nåtid last sekvestrert inne. Både stimuli og last kan skreddersys etter behov. Her beskriver vi DNA nanorobot fabrikasjonsprotokoll, med bruk av DNA origami teknikk. Fremgangsmåten starter ved å blande kort enkeltkjedet DNA stifter inn i et lager blanding som deretter tilsettes til en lang, rund, enkeltkjedet DNA stillaset i nærvær av en foldebuffer. En standard termosykler er programmert til å gradvis senke blandingsreaksjonstemperaturen for å lette stifter til stillaset gløding, som er den styrende kraft bak folding av nanorobot. Når 60 timer folding reaksjonen er fullstendig, blir overskudd av stifter kastes ved hjelp av en sentrifuge-filter, etterfulgt av visualisering via agarose-gel-elektroforese (AGE). Til slutt blir vellykket fremstilling av nanorobot verifisert ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM),med bruk av uranyl-formiat som negative flekken.

Introduction

De bruker for nukleinsyrer nanoteknologi er forbløffende. Den tractability av Watson-Crick baseparing samt den enkle og relativt lave kostnader i stor skala syntese av skreddersydde oligos ² har generert en eksplosjon av søknader ³ og forskning innen DNA nanoteknologi. Strukturelle DNA nanoteknologi, basert på det immobile Seeman krysset ^4,5 som en grunnleggende byggeblokk gjør bruk av DNA som en selvsammen elementær enhet for bygging av vilkårlige former ^6-8.

Den siste utviklingen av stillaset DNA origami ⁹ teknikken gjør det mulig for bygging av komplekse 2D / 3D nano arkitekturer ^10-12 med sub-nanometer presisjon og er en effektiv rute for å bygge nye funksjonelle objekter med økende kompleksitet og forbløffende mangfold. Byggeprosessen er basert på en lang stillas enkelttrådet DNA, vanligvis avledet fra et viralt genome, som kan brettes inn i hybridiseringen av hundrevis av korte enkeltkjedet DNA oligonukleotider betegnet stifter. Den høye strukturelle oppløsning oppnådd ved denne teknikk er et direkte resultat av den naturlige dimensjonene av DNA-dobbeltspiralen, mens reproduserbarheten av fabrikasjonen er et resultat av å skreddersy de korte enkelttråds stift sekvenser for å lette maksimal hydrogenbinding komplementaritet oppnåelig. Med bruk av en langsom temperatur annealing rampe utformet lavest energi, termodynamisk foretrekkes nanostrukturen oppnås i høye utbytter og gjengivelse. Den enkel implementering av koblingsdesignregler i en datakode aktivert utvikling av DAK-verktøy, for eksempel caDNAno ^13, som ekstremt forenkle oppgaven med å designe store, komplekse strukturer som inneholder hundrevis av tilkoblede veikryss.

Tidligere har vi beskrevet konstruksjonen av en DNA-nanorobot ved hjelp av den caDNAno verktøyet ^14,15. Her viser vi fabrikasjon ogvisualisering, via transmisjonselektronmikroskopi (TEM), av nanorobot, en 3D hul sekskantet nanodevice, med dimensjoner på 35 x 35 x 50 nm ^3, utformet for å gjennomgå en stor konformasjonsendring i respons til et forhåndsbestemt stimuli og liggende spesifikk last, f.eks som proteiner eller nukleinsyre oligos, sekvestrert inne. Mens 12 lastestasjoner er tilgjengelig inne i hule chassis, skiller det faktiske antall av bundet last med last størrelse. Cargo molekyler spenner fra små DNA-molekyler til enzymer, antistoffer og 5-10 nm gull nanopartikler. Cargocan enten være ensartet eller uensartet, slik at hver nanorobot inneholder en blanding av forskjellige molekyler. Sensing oppnås via to doble spiralformede låse porter design til fornuft proteiner, nukleinsyrer eller andre kjemikalier, basert enten på aptasensor ^16,17 eller DNA-tråden forskyvning ¹⁸ teknologier. Den siste utviklingen i aptamer valgprotokollene ^19-21 aktiver design av nanoroboter å svaretil en stadig økende utvalg av molekyler og celletyper.

Tidligere arbeid viste en nanorobot bærer et spesifikt antistoff, som ved binding til antigenet kan relé enten inhiberende eller en produktiv signal til innsiden av spesifikke celletyper i en blandet cellepopulasjon ^15. En spennende funksjon av disse nanodevices er deres evne til å utføre enda mer komplekse oppgaver og logisk kontroll med innføring av forskjellige nanorobot undertyper i en enkelt populasjon. Nylig demonstrerte vi bestemte undergrupper av nanoroboter som utfører som enten positive eller negative regulatorer, som styrer en effektor befolkningen som inneholder en aktiv last molekyl ^22.

Protokollen presenteres her beskriver fremstillingen, rensingen og avbildning av et nanorobot gated med aptamer sensor sekvenser som bindes selektivt til PDGF for å lette åpningen av nanorobot ^15,22. Fremstillingsprosessen som er beskrevet er lik nanorobot fabrikasjon prosessen opprinnelig avbildet av Douglas et al. ^{15 med} endringer for å redusere totale prosessen varighet, mens øke utbyttet og rense priser.

Protocol

1. Utarbeidelse av Staples Pool Blanding Bestill frysetørret DNA nanorobot stifter på 96-brønners plater som er oppført i tabell 1 (se Materials) og normal til 10 nmol. For en detaljert beskrivelse av design og arkitektur av DNA nanorobot se Ben-Ishay et al. 14 og Douglas et al. 15). Rekonstituer hver stift godt med DNase / RNase-fri ultrarent til en konsentrasjon på 100 uM. For stifter normalisert til 10 nmol rekonstitue…

Representative Results

Representative resultater er vist i figur 2A. Alle baner inneholder 1 ug av total-DNA, målt via spektrofotometer (OD 260). Sammenlignet med den sirkulære enkeltkjedet DNA stillas (felt 2), nanoroboter er hindret i gelen på grunn av deres høyere molekylvekt, et resultat av stifter hybridisering til stillaset DNA (Lane 3. rød pil). Den lavmolekylære bånd i Lane 3 representerer overskytende stifter som ikke binder seg til stillaset DNA (grønn pil). Etter rensing ved hjelp av sentrifugal-…

Discussion

Vi beskrev fremstilling, rensing, og visualisering av DNA nanorobot. Etter fremstillingen av den heksagonale chassis av anordningen, er funksjonen av nanorobot programmert med enkel innføring av spesifikk last og føler tråder til roboten som lett finne sin egen stilling på grunn av hydrogenbinding komplementaritet med tilgjengelige enkelttrådstilkoblingssteder ^{14 , 15,22.}

Fabrikasjon protokollen beskrevet bruker en langsom gløding rampe, som vanligvis brukes i vår lab å ka…

Materials

DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai