Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images
Summary
Her beskriver vi en arbeidsflyt for raskt å analysere og utforske samlinger av fluorescens mikroskopi bilder ved hjelp PhenoRipper, en nylig utviklet bildeanalyse-plattform.
Abstract
Til tross for raske fremskritt innen high-throughput mikroskopi, kvantitative bildebaserte analyser fortsatt utgjøre betydelige utfordringer. Mens en rekke spesialiserte verktøy for bildeanalyse er tilgjengelige, de fleste tradisjonelle bildeanalyse-baserte arbeidsflyter har bratte læringskurver (for finjustering av analyseparametere) og resultere i lang behandlingstid mellom avbildning og analyse. Spesielt celle segmentering, prosessen med å identifisere enkeltceller i et bilde, er en stor flaskehals i denne forbindelse.
Her presenterer vi en alternativ, celle-segmentering-fri arbeidsflyt basert på PhenoRipper, en åpen kildekode-plattform designet for rask analyse og utforsking av mikroskopi bilder. Rørledningen som presenteres her er optimalisert for immunfluorescens mikroskopi bilder av cellekulturer og krever minimal brukermedvirkning. Innen en halv time, kan PhenoRipper analysere data fra en typisk 96-godt eksperiment og generere bildeprofilene. Brukere kanderetter visuelt utforske sine data, utføre kvalitetskontroll på sitt eksperiment, sikre svar på forstyrrelser og sjekke reproduserbarhet replikater. Dette muliggjør en rask tilbakemelding syklus mellom analyse og forsøket, som er avgjørende under assay optimalisering. Denne protokollen er nyttig ikke bare som en første-passasje-analyse for kvalitetskontroll, men også kan anvendes som en ende-til-ende-løsning, spesielt for screening. Denne arbeidsflyten beskrevet her skaleres til store datasett slik som de som genereres av high-throughput-skjermer, og har vist seg å gruppere eksperimentelle betingelser ved fenotype nøyaktig over et bredt spekter av biologiske systemer. Den PhenoBrowser grensesnitt gir en intuitiv rammeverk for å utforske den fenotypiske plass og forholde bildeegenskaper til biologiske merknader. Til sammen vil protokollen beskrevet her senke barrierene for å ta i bruk kvantitativ analyse av bildebasert skjermer.
Introduction
I løpet av det siste tiåret, har raske fremskritt innen bildeteknologi gitt mange laboratorier evnen til å utføre høy gjennomstrømming mikroskopi. Utfordringen er nå flyttet fra en av avbildning til en av analyse. Hvordan kan vi karakterisere, sammenligne, og utforske torrent av komplekse ennå subtile fenotyper generert av en typisk high-throughput bildeskjermen?
En rekke av bildeanalyse og informatikk plattformer har gitt brukere sofistikerte verktøykasser 1-3 for utpakking biologisk informasjon fra store samlinger av bilder. Men mange betydelige hindringer gjenstår i å analysere data fra high-throughput bildebaserte skjermer. Vanskeligheter involvert i valg av passende karakteristikk av de bildene og finjustering av algoritmiske parametre (til systemet av interesse) ofte resultere i lange innstillingstider, særlig for brukere uten bilde-analysekompetanse. Spesielt celle segmentering, prosessen med å identifisere de enkelte celler i enn bilde, er en stor flaskehalsen i denne forbindelse. Segmentering kan være svært følsomme for eksperimentelle parametere som celletypen, celletetthet og biomarkører og krever ofte gjentatt justering for et stort datasett. Av disse grunner, er bildeanalyse ofte en uavhengig, terminal trinn utføres av fagfolk i stedet for en integrert del av den eksperimentelle arbeidsflyten. Dette utelukker en hurtig tilbakemelding syklus mellom analyse og eksperiment, en viktig del av analysen utvikling.
Her beskriver vi en alternativ arbeidsflyt som er optimalisert for høy gjennomstrømning fluorescensmikroskopi og unngår mange av de forannevnte vanskeligheter. For å oppnå dette, benytter vi PhenoRipper 4, en åpen kildekode-plattform for rask utforskning og analyse av mikroskopi bilder. Betydelig, unngår PhenoRipper mange av de utfordringene som er involvert med celle segmentering ved ikke å forsøke å identifisere enkeltceller. I stedet deler PhenoRipper bilder til pixelblokker av subcellulære størrelse og karakteriserer bildene i form av blokkene de inneholder. Spesielt profiler PhenoRipper blokker i form av markør-colocalization baserte funksjoner og automatisk identifiserer fire de mest representative blokktypene i treningsbilder. PhenoRipper deretter tildeler hver blokk den mest lignende representant blokktype, og til slutt karakteriserer bilder basert på hvilke typer av blokkene de inneholder.
Sammenlignet med mer tradisjonelle encellede baserte tilnærminger, denne tilnærmingen krever minimalt med finjustering og kompetanse. Som sådan brukerne trenger bare å innstille to parametre: blokkstørrelse og en terskelintensitet (for å forkaste-cellulære deler av et bilde), som begge er angitt med grafisk tilbakemelding. Viktigere, har arbeidsflyten beskrevet her blitt vist 4 å skalere lett til mye større datasett, der hastighet og minimal finjustering gir stor tid og pålitelighet gevinster. I praksis finner vi at denne appenmort reduserer den tiden som kreves både for oppsett og drift av flere størrelsesordener fire.
Den primære produksjonen av PhenoRipper er en visuell representasjon av bildet likheten, som gjør det mulig å identifisere grupper av forsøksbetingelser som forårsaker celler til å vise tilsvarende fenotyper. De grupperinger PhenoRipper finner vanligvis har sammenlignbare "biologisk interpretability" til de som skapes av mer tidkrevende, celle-baserte metoder fire. I praksis betyr dette at ofte, innen en halv time til å utføre en typisk 96-vel fluorescens mikros eksperiment, en eksperimentator uten bildeanalyse-erfaring kan få en pålitelig avlesning om utførelsen av hans eller hennes eksperiment. Eksperimentator kan deretter begynne å utforske relasjonene mellom ulike eksperimentelle forhold og om disse sammenhengene til bilde fenotyper.
Vi demonstrerer denne arbeidsflyten her ved å analysere virkningeneav narkotika i forskjellige mekanistiske klasser på HeLa celler farget for DNA og cytoskeletal markører. Bilder av celler behandlet med den samme klassen av narkotika ble gruppert sammen, og dårlig kvalitet på bilder (flekker gjenstander, ute av fokus celler og så videre) dukket opp som uteliggere, noe som gjør dem enkle å identifisere og potensielt kast.
Mens denne arbeidsflyten er nyttig for et stort antall bildebaserte analyser, er det helt klart mange situasjoner hvor en annen tilnærming kan potensielt være mer informativ. For eksempel, er utgangen fra PhenoRipper primært en relativ sammenligning av fluorescens-mønstre på tvers av eksperimentelle betingelser. Dersom en absolutt karakterisering av en bestemt enkelt celle egenskap var nødvendig i stedet (for eksempel antallet flekker i en celle), vil en enkelt-celle-baserte analyser være nødvendig. Likevel, selv i denne typen situasjon, er PhenoRipper sannsynlig å oppdage endringer i disse encellede fenotyper og derfor være et nyttig verktøy for analyse optimization.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbeidsflyten er beskrevet her gir rask og enkel karakterisering og sammenligning av mikroskopi bilder. Vi først demonstrert hvordan denne arbeidsflyten kan hjelpe eksperiment optimalisering, for eksempel ved raskt å utføre kvalitetskontroll på mikroskopi bilder. Deretter viste vi potensialet for å analysere high-throughput screening data: vi var i stand til å gruppere legemidler basert på deres virkningsmekanisme. Grupperingen av narkotika var sammenlignbar med det som ble funnet ved hjelp av mer komplekse metod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Adam Coster og alle andre medlemmer av Altschuler og Wu laboratorier for nyttig tilbakemelding og diskusjoner. Denne forskningen ble støttet av National Institute of Health gir R01 GM085442 og CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), og Welch Foundation I-1619 (SJA) og I-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm – an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. 2, 1139-1142 (2004).
