Активация и Измерение NLRP3 Inflammasome деятельности Использование IL-1β в человека моноцитов дендритные клетки

Summary

Дендритные клетки (ДК) секретируют IL-1β в ответ на распознавание TLR8 синтетического пурин, R848, с последующей активацией inflammasome NLRP3 с нигерицина, следовательно, IL-1β может быть использован для измерения активности inflammasome NLRP3. Внутриклеточного цитокина окрашивание, иммуноблотинга и ИФА используются для точного измерения NLRP3 inflammasome грунтования и активация через выражение ИЛ-1β.

Abstract

Воспалительные процессы, возникающие в результате секреции интерлейкина (IL) -1 семьи цитокины иммунными клетками привести к локальной или системного воспаления, ремоделирования ткани и ремонта, а также контроля вирусологического ^{1, 2.} Интерлейкина-1β является важным элементом врожденного иммунного ответа и способствует устранению вторжение болезнетворных микроорганизмов, предотвращая создание хронической инфекции ^1-5.

Inflammasomes являются ключом сигнализации платформа для активации интерлейкина 1 превращающего фермента (ICE или каспазы-1). Nlrp3 inflammasome требуется не менее двух сигналов в ДК, чтобы вызвать Ил-1β секрецию ^6. Экспрессия белка Pro-IL-1β ограничен в покоящихся клеток; поэтому сигнал грунтовки требуется для IL-1β транскрипции и экспрессии белка. Второй сигнал считывается результатов NLRP3 в формировании нескольких белков NLRP3 inflammasome. Способность дендритных клеток в респонденD на сигналы, необходимые для секреции IL-1β может быть проверена с использованием синтетического пурин, R848, который воспринимается TLR8 в человеческой моноцитов дендритных клеток (moDCs) в первичных клетках, а затем активацией inflammasome NLRP3 с бактериальным токсином и ионофор калия, нигерицин.

Моноцитов, полученные ДК легко получены в культуре и обеспечивают значительно больше клеток, чем очищенных человеческих миелоидных ДК. Метод, представленный здесь отличается от других анализов inflammasome в том, что он использует в пробирке человека, а мыши, полученной, таким образом позволяя ДК для изучения inflammasome в человеческой болезни и инфекции.

Introduction

Активация иммунной системы требуется, чтобы направить адаптивного иммунного ответа во время инфекции, болезней и вакцинации ^7. Дендритные клетки являются наиболее мощным антиген представляющих клеток врожденной иммунной системы; они специализируются на поглощение антигенов, миграции в лимфатические узлы, и активации наивного CD4 ⁺ и цитолитический CD8 ⁺ Т-клеток ^8-10. Чтобы включить быстрое обнаружение патогена врожденной иммунной системы использует многочисленные зародышевые кодируется рецепторы распознавания образов (ПРР), которые признают консервативный патогенных полученные мотивы или хост получены маркеры стресса и повреждения клеток. Toll подобные рецепторы (TLR,) являются мембранные связаны рецепторы распознавания образов, которые признают определенную внеклеточный фагоцитируются патоген, связанные молекулярные паттерны (PAMPs) и опасность, связанная молекулярные паттерны (DAMPS). В отличие от кивком, как рецепторов (NLRS) являются цитозольный и отвечать разнообразных PAMPs и DAMPS. Nod подобные рецепторы повторнопредставить вторую линию обороны против патогенов, которые уклоняются поверхность клеток и эндоцитотических PRRS. Взаимодействие возбудителя, полученных или «опасности» ассоциируется, факторы с TLR и РНБ лигандов приводит к состоянию постоянного созревания в результате усиления взаимодействия постоянного тока с другими иммунными клетками и продвижения Т-клеток и активации естественных клеток-киллеров ^11.

Интерлейкина-1β является одним из важнейших компонентов в защите организма против инфекции. После признания микроорганизма, высоко провоспалительных цитокинов IL-1β, секретируется и функционирует как химио аттрактанта и активатора врожденной и адаптивной иммунных клеток. В естественных условиях ИЛ-1β в значительной степени ответственна за ответ острой фазы в том числе лихорадки и цитокина Синтез ^12.

Большинство NLRS содержать C терминал лейцин богатый домен повтора, как полагают, функционируют в лиганда зондирования, центральной нуклеотидной связывающего домена (Nacht), который ИМПОrtant для NLRP3 олигомеризации, и N концевого домена эффекторной (PYD в NLRP3), который опосредует передачу сигнала в нижестоящих мишеней через белковые белковых взаимодействий. Белок Nlrp3 определяет наиболее интенсивно изучал inflammasome комплекс. Этот белок является членом семьи NLR и имеет возможность сформировать мульти молекулярного комплекса белка, состоящего из NLRP3, в PYCARD адаптер белка (также известный как ASC) и ICE. По inflammasome активации PYCARD связывается с Nlrp3 N терминальных доменов и нанимает ICE посредством активации каспазы и области найма (CARD) областей. Интерлейкин-1-превращающего фермента первоначально генерируется как зимогена, содержащей карту мотив на его N-конце. Inflammasome результаты формирования в результате чего две молекулы ICE достаточно близко, чтобы побудить их автокаталитическую активации. Inflammasome комплекс необходим для активации ICE что позволяет ему конвертировать цитоплазматический про-IL-1β, чтобы созреть цитокин.

Успешное выделение IL-1β в РС требуется зондирование двух разных и независимых сигналов опасности. Во-первых, TLR зондирование PAMPs, DAMPS или сигнализации цитокинов (ФНО или IL-1β) вызывает позитивную регуляцию цитоплазматической экспрессии про-IL-1β белка. Второй, часто отличаются, сигнал необходим для inflammasome комплексообразования вверх по течению от ICE созревания. Несколько inflammasome стимулирования сигналы включают образующие токсины бактерий мембрана пор (например, нигерицина), лизосомальные нарушения кристаллы (например, мононатрия уратов кристаллов, МГУ), и внеклеточный АТФ. Вверх по течению механизм, приводящий к NLRP3 inflammasome активацию этих разнообразных возбудителей непонятно. Исследования следственные сигнализации вверх по течению inflammasome образования предлагает, чтобы внутриклеточные события, такие как индукции гипокалиемии или активных форм кислорода (АФК) косвенно активировать inflammasome ^13-28.

Среди различных вирусных возбудителей в inflammasome NLRP3 является гриппа, который обеспечивает бВ противном первичный и вторичный сигнал, необходимый для Ил-1β секреции ^{3, 29-33.} Использование модели мыши с нокаутом NLRP3 было обнаружено, что IL-1β в ДК секреции является NLRP3 зависит ^32. Кроме того, мышей нокаутом NLRP3 привлекает меньше лейкоцитов в очаге инфекции и наблюдается повышение смертности ^{2, 5.} Два недавних работах предложить механизм для активации inflammasome NLRP3 во время гриппа вирусной инфекции; Сначала грунт через признание вирусной РНК с помощью TLR7 или TLR8 (в зависимости от экспрессии TLR отвечающего клетки), либо через зондирования синантропных бактерий другими TLRs индуцировать цитоплазматическую про-IL-1β экспрессию, с последующим вторым сигналом активации, NLRP3 inflammasome образование по вирусного белка ионного канала М2 на транс Гольджи сети ^{33, 34.} В последнем шаге, срабатывание inflammasome NLRP3 осуществляется нарушения внутриклеточного ионного <EM> среда приводит к продукции АФК, который является, просто, воспринимается NLPR3 как сигнал, чтобы сформировать inflammasome. Тем не менее, точный механизм inflammasome активации верховьях ICE деятельности в течение гриппа инфекции все еще остается неясным.

Эта работа описывает технику ценную для изучения NLRP3 inflammasome в человеческих moDCs который может быть использован в качестве основы для дальнейшего изучения пути, лежащей в основе DC основе секреции ИЛ-1β в ответ на TLR8 перевязки с R848 с последующим активации inflammasome по хорошо Известно, активатор NLRP3, нигерицин. Вариации этого метода могут быть использованы с другими типами клеток, включая, но не ограничиваясь ими: моноциты, макрофаги, других подмножеств постоянного тока и эпителиальных клеток.

Protocol

Заявление по этике: образцы исследований получены и сохранены для исследования с согласия донора. Все образцы должны быть закодированы или анонимными перед использованием. Этот протокол следует руководству нашей Institutional Review Board. 1. Дифференциация периферической крови че…

Representative Results

Эти методы измерения TLR8 заливке с R848. Внутриклеточного цитокина окрашивание на про-IL-1β позволяет микроскопии и Facs показаний от CD14 – CD11c + moDCs. Оба метода могут быть количественно относительно к не загрунтованных или отдыха, контроль клеточного, а в качестве контрольного изоти…

Discussion

Воспалительные цитокины являются неотъемлемой в рулевое врожденную и адаптивный иммунный ответ, чтобы бороться вирусную инфекцию. Выделяется Ил-1β было показано, что увеличение во время гриппа инфекции ^{3, 43, 44.} Точные механизмы, с помощью которых эти цитокины, обработанные в ответ…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707