Molekylær signalering gennem både østrogen og microRNA'er er kritiske i brystkræft udvikling og vækst. Østrogen aktiverer østrogenreceptorer, som transkriptionsfaktorer. Mange transkriptionsfaktorer kan regulere ekspression af microRNA, og østrogen-regulerede microRNA kan profileres ved hjælp af forskellige storstilede teknikker.
Østrogen spiller afgørende roller i mælkekirtlen udvikling og brystkræft progression. Det formidler sin funktion ved at binde til og aktivere østrogen-receptorer (ERS), ERa og ERβ. ERa ofte opreguleret i brystkræft og driver spredning af brystkræftceller. ERS fungerer som transkriptionsfaktorer og regulere genekspression. Betragtninger ERa regulering af protein-kodende gener er veletableret, dens regulering af noncoding microRNA (miRNA) er mindre udforsket. miRNA spiller en stor rolle i den post-transkriptionel regulering af gener, hæmme deres oversættelse eller nedværdigende deres mRNA. miRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere og er også lovende biomarkører. Blandt de miRNA assays til rådighed, har microarray og kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR) er blevet flittigt brugt til at detektere og kvantificere miRNA niveauer. At identificere miRNA reguleret af østrogen signalering i brystkræft, their udtryk i ERa-positive brystkræft cellelinier blev sammenlignet før og efter østrogen-aktivering ved hjælp af både de μParaflo-mikrofluidenheder microarrays og Dual mærkede prober-low density arrays. Resultaterne blev valideret ved bestemte qPCR assays, anvender både cyaninfarvestof-baserede og Dual mærkede prober baseret kemi. Endvidere var en tid-punkt assay anvendes til at identificere regler over tid. Fordele ved miRNA assay fremgangsmåde, der anvendes i denne undersøgelse er, at det muliggør en hurtig screening af modne miRNA regler i talrige prøver, selv med begrænsede prøvemængde. Layoutet, herunder de særlige betingelser for cellekultur og østrogen behandling, biologiske og tekniske gentagelser, og storstilet screening efterfulgt af dybdegående bekræftelser bruger separate teknikker sikrer en robust detektion af miRNA regulativer og eliminerer falske positiver og andre artefakter. Men, muterede eller ukendte miRNA eller regulativer på de primære og forløber udskrift Level, vil ikke blive registreret. Metoden præsenteres her repræsenterer en grundig undersøgelse af østrogen-medierede miRNA regulering.
Østrogen er et hormon, der er vigtigt i mælkekirtlen udvikling. Østrogen spiller også vigtige roller i udvikling, vedligeholdelse, risiko, og behandling af brystkræft 1. Østrogen udøver sin funktion ved at binde til ERS, som er transkriptionsfaktorer og regulerer specifikke target gener. Af de to receptor-varianter, ERa er afgørende for østrogen-afhængige proliferation af brystcancerceller. De fleste brystkræft er ERa-positive og afhænger af østrogen for vækst. Det har gjort østrogen signalering og ERa et mål for behandling i hormon-receptor positiv brystkræft. Er vigtigt at forstå den underliggende mekanisme af ERa at forbedre behandlingsresultater, overvinde modstand mod behandling, og forstå, hvordan brystkræft udvikler sig.
miRNA spiller afgørende roller i celle funktioner på grund af deres større indvirkning på posttranskriptionel genregulering. miRNA er 19-24 nukleotider korte, enkeltstrengede, Noncoding RNA, der først transskriberet af RNA-polymerase II i primære miRNA udskrifter (pri-miRNA). De behandles i kernen af drosha i korte hårnål precursor-miRNA (pre-miRNA) og derefter behandles af Dicer og opdelt i enkelt-strenge til at danne modne miRNA i cytoplasmaet. De enkelt-strengede modne miRNA overføres til Argonaute proteiner til at danne RISC kompleks. Derefter kan miRNA hybridiserer til 3'-utranslaterede regioner (3'-UTR) af et mål-mRNA, der fører til post-transkriptionel regulering ved at blokere translation eller nedbryde target mRNA'en 2.
På grund af den vigtige rolle, som både østrogen og miRNA spiller i tumorprogression, identificere miRNA forbundet med normal eller forstyrres østrogen signalering er vigtig for at øge vores forståelse af udviklingen og forbedre behandlingen af brystkræft. Mens der er en god forståelse af, hvordan ERa regulerer protein-kodende gener, udvidelseog detaljer om noncoding RNA regler stadig at blive grundigt undersøgt. Indledende undersøgelser har til formål at belyse ERa regulering af miRNA i brystkræft cellelinier har givet modstridende resultater, selv når samme cellelinje er blevet analyseret 3-6. Dette kan være et resultat af forskellige behandlinger, biologiske variationer anvendelse af forskellige teknikker, og det faktum, at den lille størrelse af miRNA gøre dem udfordrende at analysere. Her er en protokol, der styrer for variationer og metode artefakter beskrevet.
At identificere, hvilke miRNA er reguleret af østrogen, profilering af en veldefineret brystkræft model af ERa aktivitet er et første skridt. Adskillige cellelinier er blevet genereret fra humane ERa-positiv brystkræft tumorer, der er afhængige af østrogen svarende til størstedelen af de kliniske brystkræft. De molekylære egenskaber af to af disse cellelinjer, T47D og MCF7, herunder udtryk for ERa og dens downstream mål,progesteron hormon receptor (PR), manglende ekspression af membran-receptor HER2, sammen med ekspressionen af østrogen-responsive og luminale-epitel-differentiering gener, som gør dem egnede som modeller for den luminale undertype af brysttumorer 7-10. 17β-østradiol (E2) er den dominerende form for østrogen, og koncentrationer og tidspunkter for optimal transkriptionsaktivering af ERa blevet karakteriseret i flere studier. I denne protokol 10 nM E2 behandling i 24 timer er brugt og T47D og MCF7 som modeller for ERa aktivitet i brystkræftceller 1. Desuden kan tidsafhængige miRNA forskrifter specifikt analyseret i et tidsinterval på fx 1-72 timer.
For det andet, analysere miRNA har separate udfordringer, dels på grund af deres korte størrelser. miRNA er ikke godt bevaret i den totale RNA præparat, når regelmæssige Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA udfældninger udføres, eller når stAndard kolonne rensninger anvendes. Særlige forholdsregler der skal træffes for at opretholde eller berige for den mindre fraktion af RNA. Ved at øge mængden af isopropanol, sænke temperaturen før centrifugering (-80 ° C) og udeladelse af vask i 70% ethanol, kan fastholdelse af miRNA forstærkes nedbør. Eller kan bruges bestemte kolonner og buffere til et præparat af miRNA-holdige total RNA høj kvalitet og robust. Også for selve analysen, deres korte størrelser skaber udfordringer. For genome-wide miRNA screening, der er tre almindelige miRNA profilering teknikker til at vælge imellem: microarrays, qPCR og næste generation sekventering. Hver teknik kan udføres ved hjælp af flere forskellige platforme, og forskellige præparater prøve er påkrævet, hver med forskellige risici for at indføre artefakter. I miRNA microarray, er et dias plettet eller syntetiseret med tusindvis af oligonukleotider. Disse oligonukleotider anvendes som prober, og hver af probens er udformet til at hybridisere til en bestemt miRNA sekvens. Den prøveforberedelse for microarrays, som udføres i denne undersøgelse, først beriger for miRNA og derefter introducerer Cy5 og Cy3 mærkning på miRNA. Microarray giver mulighed for at observere de relative ekspressionsniveauer af et stort antal gener samtidigt, er hurtig og velegnet til screening af et stort antal prøver, men kan kun analysere sekvenserne til stede på microarray og vil fx ikke påvise ændringer i ukendt eller muteret miRNA. Microarray analyse som udføres i denne protokol kræver også relativt store mængder, omkring 5 ug af total RNA per prøve til analyse. Low-density qPCR miRNA-profilering kræver mindre materiale (700 ng / prøve og replikere), og giver mulighed for detektion og kvantificering af miRNA. Kan bestemmes transkriptniveauer, og mængden kan være en absolut beløb eller en relativ mængde. qPCR analyse først kræver konvertering af miRNA i cDNA, her ved hjælp af en buetprimer for hver specifikke miRNA sikrer analyse af kun modne miRNA. Dette frembringer en længere skabelon, der kan forstærkes udnytte en miRNA-specifik fremadrettet primer og en revers universel primer komplementær til sekvensen i løkke og kan harbor optagelse af en Dual mærkede probe for specificitet. qPCR kan anvendes i en lav-densitet-format, hvor hundredvis af miRNA kan påvises i parallel ved hjælp af en eller flere 384-brønds plader med de enkelte primerpar i hver brønd 11. Næste generation sekventering på den anden side er den eneste af disse teknikker, der giver mulighed for opdagelsen af hidtil ukendte, muterede eller redigeret miRNA, da alle RNA i en prøve kan sekventeres 11. Denne teknik kræver imidlertid flere trin, som vil berige små RNA'er og producere en lille RNA-bibliotek ved hjælp af flere trin af linker-ligeringer og rensninger med efterfølgende forøgede risiko for at modulere deres relative ekspressionsniveauer mellem prøverne. Det kræver også betydelige bioinformatics analyse. I betragtning af de forskellige teknikker til miRNA-profilering, den mest hensigtsmæssige teknik afhænger af de programmer. Microarrays er mest velegnet, når materialet er relativt rigelige og interessen er at definere forskellen udtryk for allerede kendte miRNA. Low-density qPCR arrays er mest egnet, når en begrænset mængde af prøven er til rådighed, og en høj følsomhed af lav-udtrykte miRNA er påkrævet. Sekventering er mest velegnet, når analysen af ukendte miRNA, muterede eller forskellige isoformer af et miRNA er påkrævet.
I undersøgelsen af østrogen-regulerede miRNA i brystkræft, er to model cellelinjer anvendte T47D og MCF7, hvor store mængder af RNA er let tilgængelige. Hver cellelinje blev analyseret i replikerede cellekulturer ved hjælp af forskellige passager, der hver tekniske gentagelser af behandling. Dette giver mulighed for robust detektion af reproducerbart, ERa regulerede miRNA. Relative miRNA udtryk niveauer blev sammenlignet ved hjælp af både miRNA microarray ogDual mærkede prober – lav densitetsarrays (DLP-LDA) og valideret resultaterne med specifik qPCR bruger både cyaninfarvestof og DLP kemi. miRNA forordninger blev derefter yderligere analyseret i tidsserier til at definere deres nøjagtige regulering over tid, hvilket kan hjælpe med at differentiere tilfældige eller døgnrytmen variationer fra østrogen-induceret regulativer og angive primære virkninger fra sekundære effekter. Bioinformatiske sammenligninger med kromatin-bindende studier af ERa yderligere kan støtte i differentiering af primær versus sekundære effekter. Analysen resulterede i en pålidelig vurdering af miRNA regler, hvor det kunne konstateres, at efter 24 timer E2 behandling protein-kodende udskrifter var let reguleret, men modne miRNA var ikke påvirket 1.. Det er dog muligt, at miRNA er reguleret på senere tidspunkter, som påvist i tidsserieanalyser af udvalgte miRNA 1. Detaljerne skal undersøges nærmere, og den protokol, der præsenteres her giver en Robust måde at studere hormonelle regulering af modne miRNA i brystcancercellelinjer.
Bestemmelse af mekanismen til hormonelle regulering af miRNA i brystkræftceller kan give en platform for at forstå denne sygdom og kan give potentiel behandling for brystkræft. Dyrkning af disse celler til at give den optimale betingelse for hormonaktivitet er meget vigtig. Her er en protokol, der sikrer, at hormon af interesse (østrogen) blev udelukket før behandling, og at en optimal dosis af E2 blev anvendt til et passende tidspunkt under behandling er blevet beskrevet. Andre hormonale og vækstfaktor effekter blev holdt på et minimum ved gradvist at sænke serumniveauer og bruge DCC-FBS, der er FBS, der er blevet frataget de fleste af sine hormon, cytokiner og vækstfaktorer. Phenolrødt-frie medier blev yderligere anvendes til at minimere andre nonhormonal virkninger, eftersom phenolrødt er blevet rapporteret at have østrogen aktivitet og påvirke visse funktioner i cellelinier 20,21. Tidspunktet for eksponering af cellerne til hormonet er af stor betydning. Østrogen-associeret regulering af gener, er det tidligere vist, at 24-hrexposure producere signifikant respons direkte målgener i brystcancerceller 1,18. Da miRNA transskriberet af RNA-polymerase II, som mRNA'er, er det tænkeligt, at det er et passende tidspunkt til at detektere direkte regulering også miRNA. Det er endnu ikke fastlagt, om og hvordan disse miRNA påvirker ekspressionen af disse kendte ER mål i brystkræftceller.
analyse af miRNA kan være en udfordring på grund af den relativt lille størrelse af miRNA, at den modne miRNA sekvensen kan også findes i pri-miRNA og pre-miRNA, og på grund af heterogenitet i deres GC-indhold 22. Adskillige teknikker til profilering og kemier er blevet anvendt til at overvinde denne vanskelighed. Blandt disse er forskellige tilgange af microarray og qPCR analyse (Figur 2). Selvom microarray er almindeligt accepteret for hele genomet analradiokemiske analyser, kan det give falsk negative, og der findes forskelle mellem de tilgængelige platforme, lige fra kemi til printteknologi 23. Også normaliseringsproces er en udfordring, når man analyserer de relativt få miRNA gener, som tælles i tusinder i forhold til de titusinder af mRNA udskrifter. qPCR, på den anden side, er mere følsom, og er bedre anvendes, når færre gener der skal overvejes. Når den udføres i store 384-brønds plader, med kun én teknisk replikat per plade, behov for flere plader imidlertid skal analyseres for hver prøve, som gør analysen dyrt. Også i vores hænder, var der mange flere falske negative resultater er opnået ved hjælp af DLP-LDA analyse sammenlignet med microarray. Eftersom den modne miRNA sekvens er til stede i den pri-miRNA og præ-miRNA-sekvenser, er det af interesse at skelne mellem disse transkripter under anvendelse af PCR teknikker 24. DLP sonder er tilgængelige også for pre-miRNA, og specific primere kan også være udformet til at udelukke forskellige modne eller precursor varianter hjælp cyaninfarvestof qPCR-teknologi.
qPCR er en gylden standard for validering af differentieret udtryk fra profilering resultater. Effektiviteten af qPCR, afhænger imidlertid af en række parametre, herunder RNA ekstraktion, RNA integritet (kvalitet), cDNA syntese, primer design, afsløring metode (kemi), og henvisningen genet for data normalisering 1,22,25. Mulighederne for primer design for miRNA-analyse er meget begrænset, idet den korte miRNA sekvenslængde ikke giver plads til meget alternativ primer design, og kun én primer kan huses i denne korte sekvens. Der er således behov for alternative manipulationer som illustreret i figur 2. Tekniske gentagelser er vigtigt at validere robusthed amplifikationsmetoden og den anvendte proces. Er nødvendige biologiske replikater for en repræsentation af den generelle biologiske Variation, herunder responsvariabel ligand behandling, og for at vise, at de observerede virkninger i en celle er reproducerbare. Baseret på vores erfaringer, kan variationer i miRNA-ekspression mellem cellekulturer forekomme. Disse forskelle er normalt mindre end 1,3 gange, og gennemsnittet af værdierne og tilsvarende SD identifikation af den fysiske og teknologiske variation. Denne variation kan skyldes forskellige faktorer, herunder, celledensitet og at cellefunktioner kunne skifte fra passage til passage. At identificere statistisk signifikante udtryk som følge af ligand behandling, en bredt accepteret betydning er, når p-værdien er mindre end 0,05. Her har en student t-test på de biologiske og tekniske gentagelser ved hjælp af tosidet fordeling og to stikprøver ulige varians parametre været anvendt. Andre t-test parametre eksisterer, og valget afhænger af forsøgsopstillingen 26.
En detaljeret protokol i evalueringen hormonelle forskrifter modne miRNA i brystkræftceller er tilvejebragt. Vigtige teknologier og kemi i profilering og validering af disse miRNA udtryk er blevet tydeligt forklaret. Den valgte til undersøgelser af miRNA i brystkræftceller teknologi i sidste ende afhænger af, hvad der præcist er ved at blive undersøgt.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Dr. Xiaolian Gao, University of Houston, for at rådgive LC Sciences miRNA microarray platform, Dr. Karin Edvardsson, Karolinska Instituttet, Sverige og Dr. Eylem Aydogdu, University of Houston, for at dele deres miRNA ekspertise . Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award nummer R01CA172437. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. Dette arbejde blev også støttet af tilskud fra Texas Emerging Technology Fund, i henhold til aftale nr. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |