Excitotoksiske Stimulering af Brain Microslices som en<em> In vitro</em> Model of Stroke
Summary
Vi har udviklet en hjernesnit model, som kan anvendes til at undersøge molekylære mekanismer involveret i excitotoksicitet medieret hjerneskade. Denne teknik genererer levedygtige modne hjernevæv og reducerer antallet af dyr, der kræves for at eksperimentere, samtidig med at den neuronale kredsløb, cellulære interaktioner og postsynaptiske rum delvis intakt.
Abstract
Undersøgelse molekylære mekanismer involveret i neuropatologiske tilstande, såsom iskæmisk slagtilfælde, kan være svært, når anvendelse af hele dyresystemer. Som sådan primær eller 'neuronal-lignende "cellekultursystemer almindeligvis udnyttes. Selv om disse systemer er relativt let at arbejde med, og er nyttige modelsystemer, hvor forskellige funktionelle udfald (såsom celledød) kan let kvantificeres, de undersøgte resultater og veje i dyrkede umodne neuroner (såsom excitotoksicitet medieret celledødsveje) er ikke nødvendigvis de samme som dem, der observeres i modne hjernen eller i intakt væv. Derfor er der behov for at udvikle modeller, der kan undersøges cellulære mekanismer i moden nervevæv. Vi har udviklet en in vitro-teknik, der kan bruges til at undersøge en række molekylære veje i intakte nervevæv. Den beskrevne teknik anvender rotte cortexvæv, men denne teknik kan tilpasses til at anvende vævfra en række forskellige arter (såsom mus, kaniner, marsvin og kylling) eller hjerne-regioner (for eksempel, hippocampus, striatum, osv.). Derudover kan der anvendes en række stimulationer / behandling (for eksempel excitotoksisk indgivelse af inhibitorer, osv.). Sammenfattende kan hjernen skive model beskrevet heri anvendes til at undersøge en række molekylære mekanismer involveret i excitotoksicitet medieret hjerneskade.
Introduction
Den mest almindelige form for slagtilfælde er iskæmisk slagtilfælde, der opstår, når en cerebral blodkar bliver okkluderet. Den vævsiskæmi som resulterer fra ophør af blodgennemstrømning forårsager omfattende depolarisering af membraner, frigivelse af excitatoriske neurotransmittere og vedvarende forøgelse af intracellulært calcium, hvilket fører til aktivering af celledødsveje 1. Denne proces er blevet kaldt "excitotoksicitet" og er en fælles pathway involveret i neuronal død produceres ved en række af sygdomme, herunder slagtilfælde 2. Hæmning af signalveje, der er involveret i excitotoxicity og andre neuroncelledød kaskader er en tiltalende tilgang til at begrænse nerveskader efter slagtilfælde.
Identifikation af præcise molekylære mekanismer involveret i excitotoxicity og iskæmisk slagtilfælde kan være svært, når du bruger hele dyresystemer. Som sådan primær embryonale og "neuronal-lignende" (f.eks neuroblastoma og adenocarcinom udødeliggjort linjer) cellekultursystemer anvendes ofte. De vigtigste fordele ved disse modeller er, at de er nemme at manipulere, forholdsvis omkostningseffektive, og celledød let kan måles og kvantificeres. Dog kan signalveje ændres af de anvendte dyrkningsbetingelser 3,4, og umodne neuroner og udødeliggjorte linier kan udtrykke forskellige receptorer og signalmolekyler i forhold til modne hjerne 5-8. Desuden dyrkede neuroner kun mulighed for at undersøge en celletype (eller to, hvis der anvendes en cokultur-system), mens intakt hjernevæv er heterogen, som indeholder en række celletyper, der interagerer med hinanden. Organotypiske slice dyrkningssystemer (tynde eksplantater af hjernevæv) bruges også, og disse modeller tillader undersøgelse af heterogene populationer af celler, som de er fundet in vivo. Dog kan kun en begrænset mængde af væv opnås fra hvert dyr, når du bruger denne teknik, skiver kanikke dyrkes så længe udødeliggjort cellelinjer, og på mellemlang til lang sigt kultur kan resultere i ændringer i signalveje og receptorer i skiver. Mens modne hjerne kan bruges til at generere organotypiske skiver, skiver fra umodne hjernen er mere modtagelig for kultur, og er mere almindeligt anvendt. Der er derfor behov for at udvikle modeller, der efterligner eller repræsenterer intakte modne hjerne, der er nemme at bruge, hvor der kan undersøges neuronale signalveje.
Heri er en in vitro-teknik, der involverer intakt nervevæv, der kan anvendes til at belyse molekylære mekanismer, der er involveret i celledød efter en excitotoksisk eller iskæmiske skade beskrevet. Denne teknik reducerer antallet af dyr, der kræves for at udføre et eksperiment, er reproducerbar og frembringer levedygtige væv, der opfører sig på en metabolisk måde svarende til større organotypiske skiver. Derudover neuronale kredsløb, cellulære interaktioner og postsynaptiske compartment forbliver delvist intakt. Den fysiologiske buffer anvendte tillader cellemembranerne 'genlukningsindretning', og giver celler til at genvinde deres oprindelige membran modstand 9. Denne hjerne skive model er i stand til trofast efterligne observeret respons efter excitotoxicity medieret hjerneskader 10, og kan bruges til at undersøge de molekylære mekanismer involveret i slagtilfælde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri er en in vitro-teknik til generering af microslices, der kan bruges til at undersøge de molekylære mekanismer involveret i excitotoxicity og iskæmi-medieret celledød i intakt modne hjernevæv beskrevet. Denne teknik frembringer levedygtige væv (fig. 1-3), der er metabolisk ligner større organotypiske skiver 15. Desuden er denne microslice model nøje svarer til den respons efter excitotoxicity medieret hjerneskader in vivo 10. En 90 sekunder in vitr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af forskningsmidler fra Sundhed og Medical Research Council National Australien, Hunter Medical Research Institute og University of Newcastle.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
