DNBs / TNBS indusert kolitt tilbyr et alternativ og billig metode for å studere patobiologi av inflammatorisk tarmsykdom. Protokollen diskutert i dette notatet skisserer vellykket bruk av DNBs å indusere kolitt hos mus og rotter, og tillater en å grundig studere verts-mediert tarm svar.
Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), inkludert Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, har lenge vært assosiert med en genetisk basis, og i den senere vert immunresponser mot mikrobielle og miljømessige midler. Dinitrobenzen sulfonsyren (DNBs)-indusert kolitt gjør det interessant å studere patogenesen ved IBD tilhørende miljø triggere som stress og kosthold, effekten av mulige behandlingsformer, og de mekanismene bak tarmbetennelse og slimhinneskader. I denne artikkelen har vi undersøkt effekten av kosttilskudd n-3 og n-6 fettsyrer på colonic slimhinnene inflammatorisk respons på DNBs-indusert kolitt hos rotter. Alle rotter ble foret med dietter identiske med unntak av forskjellige typer fettsyrer [saflorolje (SO), rapsolje (CO), eller fiskeolje (FO)] i tre uker før eksponering for intrarektal DNBs. Kontroll rotter som fikk intrarektal etanol fortsatt økende vekt over 5 dagers studie, mens, DNBs-behandlede rotter matet lipid dietter alle lost vekt med FO og CO matet rotter viser betydelig vekttap ved 48 hr og rotter matet SO etter 72 timer. Vektøkning gjenopptatt etter 72 timers legg DNBs, og etter 5 dager etter DNBs, FO gruppen hadde en høyere kroppsvekt enn SO eller CO grupper. Colonic seksjoner samlet fem dager etter DNBs-behandling viste fokus sårdannelse, krypten ødeleggelse, beger celle uttømming, og slimhinne infiltrasjon av både akutte og kroniske betennelsesceller som skilte i alvorlighetsgrad mellom diet grupper. SO matet gruppen viste den mest alvorlige skaden fulgt av CO, og FO matet grupper som viste den mildeste graden av vevsskade. Tilsvarende colonic myeloperoxidase (MPO) aktivitet, en markør av nøytrofile aktivitet var signifikant høyere i SO fulgt av CO matet rotter, med FO matet rotter har betydelig lavere MPO aktivitet. Disse resultatene viser at bruken av DNBs-indusert kolitt, som beskrevet i denne protokollen, for å bestemme virkningen av dietten i patogenesen av IBD.
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er karakterisert ved kronisk tilbakevend betennelser i mage-tarm (GI)-tarmkanalen, noe som resulterer i symptomer på diaré, vekttap, og abdominale smerter. Ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD) er de to store former for IBD, og kan skilles ved plasseringen av inflammasjon i mage-tarmkanalen. I UC-pasienter, betennelse innebærer vanligvis i rektum og strekker contiguously opp i tykktarmen for en variabel grad påvirker bare den overfladiske mucosa. I motsetning til dette kan CD påvirke enhver del av GI-systemet, selv om den overveiende innvirkning på ileum og cecum. CD ofte manifesterer seg som transmural betennelse som ofte forbindes med granulomer og fører til stricturing (fibrostenotic) og / eller gjennomtrengende (fistulizing) sykdom. Selv om etiologien av IBD fortsatt ukjent, er det vel akseptert at IBD er multifaktoriell, involverer interaksjoner blant vertene immunsystem, genetisk sårbarhet og ansvarses til miljømessige og mikrobielle faktorer.
Hittil har forskjellige modeller av IBD er foreslått som vise ulike kliniske, histologiske og immunresponser karakteristisk for UC og CD. De mest brukte modeller inkluderer genmodifiserte mus (IL-2, IL-10, SAMP / YIT), infeksjon indusert modeller (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptivoverføringsmodeller (CD45 + RB Høye, CD62L + celle overføring til SCID mus) og kjemisk indusert kolitt modeller (Dextran Natriumsulfat (DSS), Trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) og dinitrobenzen-sulfonsyre (DNBs)). På grunn av deres lave kostnader og hurtig innsettende sykdom, er kjemiske modeller vurderes uvurderlig til studiet av ulike aspekter ved IBD. Hver av de kjemiske kolitt modellene som er oppført har fordeler samt begrensninger i noen aspekter av deres kliniske, immunologiske og histopatologiske relevans til IBD. DSS er en av de mest vanlige kjemiske fremgangsmåter som anvendes for å indusere colitis hos gnagere en. Administrasjon av 3-10% DSS (MW: 42 kDa) i 7-10 dager i drikkevannet av mus kan indusere symptomer og tegn på kolitt, inkludert vekttap, diaré med blod, colonic forkorte, mucosal sårdannelse og nøytrofile infiltrasjon. Denne modellen er spesielt nyttig for medikamentscreeningstudier, i tillegg til å utforske de mekanismer epitelial av regenerering, virkningen av medfødt immunitet på slimhinne homeostase, og rollen til betennelser i å fremme tarm dysplasia og adenokarsinom utvikling. Det er imidlertid noen ulemper for DSS-modellen, herunder variasjon i konsentrasjonen av DSS som trengs for å indusere kolitt hos forskjellige dyrefasiliteter, så vel som inkonsistente vannopptak ved mus og således inkonsekvente eksponering mot DSS, som resulterer i variasjoner i graden, utstrekning og Fordelingen av slimhinneskade og sår i tykktarmen. Alle disse funksjonene føre til heterogenitet av resultater og begrense muligheten til å sammenligne resultater på tvers av studier frOM ulike forskningsmiljøer.
Et alternativ til DSS modellen er haptenen-indusert DNBs eller TNBS modeller av kolitt. Denne modellen benytter rektal instillasjon av mucosal sensibiliserende agenter DNBs eller TNBS, fortynnet i varierende konsentrasjoner av etanol. Administreringen av etanol er en forutsetning for å bryte den colonic mucosal barriere for å tillate inntrengning av DNBs eller TNBS inn i lamina propria. DNBs / TNBS vil da haptenize de lokaliserte kolon og gut mikrobielle proteiner for å bli immunogene, og dermed utløser verten medfødte og ervervede immunresponser. Generelt er denne modellen forbundet med alvorlige og noen ganger blodig diaré, vekttap og tarm fortykkede imidlertid symptomer varierer avhengig av typen av gnager benyttes, så vel som tidspunkt, dose og graden av eksponering for DNBs eller TNBS som brukes i studien. Viktige forskjeller mellom rotter og mus bør bemerkes, med fordelene av lavere kostnader for kjøp og styret, samt lower kroppsvekt for å redusere per-dyr kostnadene for behandling in vivo. Dette bør settes mot raskere og mer alvorlig forløp av kolitt hos mus, der de mer skjøre og følsomme dyr kan raskt nå en human endepunkt.
Den intestinal inflammasjon opprinnelig resulterer fra etanol indusert skade på intestinale epitelceller, som fører til økte epithelial permeabilitet, mikrobiell penetrasjon inn i mucosa, haptenization vertsproteiner, alt dette resulterer i infiltrasjon av nøytrofiler, makrofager og T-lymfocytter Th1 inn i det skadede mucosa. I forhold til DNBs er TNBS betraktes som et farlig kjemisk på grunn av sin svært oksidative egenskaper som kan utgjøre en risiko for eksplosjon ved kontakt med baser slik som natrium-og kalium-hydroksyd. Derfor DNBs er ansett som en foretrukket valg av kjemisk løpet TNBS å indusere kolitt. I gnagere, er DNBs kolitt ansett som en av de mest praktiske metoder for å studere den følfløyen IBD forbundet modifikatorer av sykdom:
I sammenligning med DSS modellen, fordelene ved DNBs og TNBS-indusert kolitt omfatter lav pris, rask utvikling av kolitt (krever vanligvis 1-3 dager for å vise reproduserbar sår og inflammasjon) og konsistent lokalisert skade på den distale colon. Men ulempene er en forutsetning for enstørre grad av teknisk ekspertise, optimalisering av DNBs / TNBS dose, og behovet for anestesi for rektal administrasjon.
I denne metode papir studerte vi effektene av varierende konsentrasjoner av n-6 og n-3 flerumettede fettsyrer på å endre den colonic mucosal respons på DNBs-indusert kolitt hos rotter ved hjelp av vegetabilske oljer saflorolje (SO) og rapsolje (CO) , og fiskeolje (FO). Det har vist seg at n-6 og n-3 fettsyrer, er viktige formidlere av inflammatorisk sykdom gjennom tarm deres rolle som acyldelene cellemembranen phosopholipids 9. I motsetning til den proinflammatoriske potensialet av n-6 fettsyrer, n-3 fettsyrer med tilstrekkelig høyt inntak er potensielt potente anti-inflammatoriske midler. Den anti-inflammatoriske handlingene til n-3 fettsyrer er mediert direkte gjennom erstatning av arakidonsyre som eicosanoid substrat, inhibering av arachidonsyre metabolismen og indirekte via forandring av proinflammatory genuttrykk og cellesignalering. De n-3-fettsyrer også gi opphav til resolviner, en familie av anti-inflammatoriske mediatorer. Høy inntak av n-3 fettsyrer er assosiert med en reduksjon i produksjon av proinflammatoriske eikosanoider, cytokiner, kjemokiner, reaktive oksygen-arter og ekspresjonen av adhesjonsmolekyler. I denne studien ble rotter foret ad libitum dietter identiske i alle næringsstoffer bortsett fettsyrer, og som en prosent energi fra fett, 20% SO, 20% CO, og 18% fiskeolje pluss 2% saflorolje (FO) 10-11 . Som andel av det daglige energi, SO diett gitt 15% linolsyre (LA), med <0,06% α-linolensyre (ALA) og ingen eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA), CO-diett hadde 4.2 % LA og 1,9% ALA uten EPA eller DHA, og FO diett gitt EPA 1,4%, 4,9% DHA, 0,32% LA og 0,12% ALA. Tre uker etter initiering av lipid-dietter, ble musene administrert intrarektal DNBs eller 50% etanol og avlivet 5 dager senere. Den inflammatory responsen ble vurdert ved vurdering av vekttap, histologiske skader resultatene og vev myeloperoksidase-aktivitet.
Den DNBs modellen som beskrives i denne protokoll er et verdifullt, billig og reproduserbar kolitt-modell som kan bli anvendt for å studere forskjellige aspekter av IBD. Når administreres intrarectally til rotter eller mus, induserer DNBs en betydelig grad av betennelse og vevsskade i tykktarmen, ligner menneskelige Crohns sykdom i form av dens ulike histologiske funksjoner, inkludert transmural infiltrasjon av polymorfnukleære celler og dominerende NF-κB-avhengig Th1 aktivering.
Denne m…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av driftsstøtte til KJ fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) og Crohns og kolitt Foundation of Canada (CCFC). VM er støttet av en CFRI Fellowship og GB utdannet studieplass fra den kanadiske Institutes for Health Research (CIHR). BAV er et barn med tarm og leverlidelser Foundation (BARN) Chair of Pediatric IBD Forskning og Canada Research Chair i Pediatric Gastroenterology og KJ er en erfaren kliniker Scientist støttes av barnet og barnet og familien Research Institute (CFRI) Lege Forskere Award Program , University of British Columbia.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
19 gauge needle | BD Biosciences | 305187 | |
Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intra-rectal administration in mice |
Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intra-rectal administration in rat |
DNBS | MP Bio | 150959 | |
tear gel | Novartis | 63601662596 | |
10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
O-dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
Spectrophotometer | BIORAD | Benchmarker Plus | |
Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | San Diego California USA, www.graphpad.com |