Denne protokol anmeldelser Electric Cell-substrat Impedans Sensing, en metode til at registrere og analysere impedans spektrum af klæbende celler til kvantificering af cellevedhæftning, proliferation, bevægelighed og cellulære reaktioner på farmakologiske og giftige stimuli. Påvisning af endotelpermeabilitet og vurdering af celle-celle og celle-substrat kontakter fremhæves.
Elektrisk celle-substrat Impedans Sensing (ECIS) er en in vitro-impedans målesystem at kvantificere adfærd af celler i vedhængende cellelag. Til dette formål dyrkes celler i særlige kultur kamre på toppen af modsatrettede, cirkulære guld elektroder. Påføres en konstant lille vekselstrøm mellem elektroderne og potentialet tværs måles. De isolerende egenskaber af cellemembranen skaber en modstand mod den elektriske strøm resulterer i en øget elektrisk potentiale mellem elektroderne. Måling cellulær impedans på denne måde tillader automatiseret undersøgelse af cellevedhæftning, vækst og morfologi, funktion og motilitet. Selvom ECIS selve målingen er ligetil og let at lære, den underliggende teori er kompleks og udvælgelse af de rigtige indstillinger og korrekt analyse og fortolkning af data er ikke selvindlysende. Men en klar protokol beskriver de enkelte trin fra den eksperimentelledesign til forberedelse, gennemførelse og analyse af forsøget er ikke tilgængelig. I denne artikel princippet om grundlæggende måling samt mulige anvendelser, er eksperimentelle overvejelser, fordele og begrænsninger ved ECIS systemet diskuteret. En guide stilles til rådighed for studiet af cellevedhæftning, breder og våbenspredning kvantificering af celle adfærd i en sammenflydende lag med hensyn til barriere funktion, celle motilitet, kvaliteten af celle-celle og celle-substrat sammenvoksninger, og kvantificering af sårheling og cellulære reaktioner på vasoaktive stimuli. Repræsentative resultater diskuteres baseret på human mikrovaskulære (MVEC) og menneskelige navlestrengen vene endotelceller (HUVEC), men gælder for alt vedhængende voksende celler.
ΩΩΩHere vi præsenterer Electric Cell-substrat Impedans Sensing, der er kendt som ECIS, en særlig metode til at måle og analysere impedans spektrum af adhærente celler i kultur 1. Formålet med denne protokol er at tilbyde en generelt gældende vejledning for brugen af denne særlige form for impedans baserede cellulære assays og give protokoller for nogle af de vigtigste funktioner fra det konstant voksende antal ansøgninger. Der vil være fokus på studiet af celleproliferation, barriere funktion, celle vejkryds, og celle motilitet.
Siden ECIS og dens tilhørende model til at omdanne impedans spektroskopi data i biologisk relevante parametre blev introduceret i sin nuværende form til det videnskabelige samfund ved Giaever og Keese i 1991 2, er det ofte blevet omtalt som et system til måling af TEER (trans -epitel elektrisk modstand), der ikke er korrekte. Forskellene synes marginal i starten, mener vigtige for fortolkningen af data. For klassiske TEER målinger dyrkes celler på gennemtrængelige filtrene til at karakterisere paracellulære transportmekanismer, der er domineret af epiteliale stramme vejkryds eller endotel adherens vejkryds 3. Sædvanligvis er to elektroder anbragt over og under det filter, der anvendes til at anvende en jævnstrøm (DC) strømmer over cellelaget og to andre elektroder til at måle den resulterende spændingsfald 4. Den elektriske modstand er beregnet ved hjælp af Ohms lov, som giver en numerisk beskrivelse af kvaliteten af cellen barriere.
ECIS følger dette grundlæggende princip og udvider det. I ECIS systemet dyrkes celler på modsatrettede, cirkulære guld elektroder, der er indlejret i bunden af særlige cellekultur retter. Antallet af elektroder pr dyrkningsbrønd er variabel, afhænger af anvendelsen, og elektroderne har en standard diameter på 250 um, og i nogle tilfælde et større modelektrodeanvendes til at fuldende kredsløbet. ECIS anvender en konstant vekselstrøm (AC) på 1 uA med en given frekvens i stedet for en jævnstrøm. Impedansen er beregnet ud fra de tilsvarende ændringer i spænding (i mV) mellem elektroderne. ECIS giver mulighed for at måle impedans over et område af frekvenser for at studere frekvens afhængige cellulære egenskaber, som har flere fordele i forhold TEER og vil blive forklaret i detaljer i denne artikel. Først måler komplekse impedans tillader adskillelse af samlede impedans i cellebarriere modstand og celle kapacitans. Desuden ved at data på flere frekvenser og anvender en matematisk model, kan man skelne mellem forbindelsesepitop impedans (tæthed af celle-celle-kontakter) og impedans forårsaget af celle-substrat-vekselvirkninger (afstande af basalcelle membranen til underliggende matrix) samt bidrag af cellemembranen kapacitans. For det andet kan celleproliferation og motilitet vurderes, idet cellens er i direkte kontakt med elektroderne. For det tredje, substrat og elektroder er tilstrækkeligt tynde for at tillade lys felt og fasekontrast mikroskopi.
Grundlag for impedansmålinger: Den komplekse impedans
Grundlaget for måling af den elektriske impedans af biologiske objekter (fx celler) er Ohms lov, en grundlæggende elektro-teknisk princip, der beskriver forholdet mellem modstanden (R), (I) og spænding (U) i et elektrisk kredsløb på et givet tidspunkt (t).
Gælder i DC kredsløb: R (t) = U (t) / I (t)
Når du arbejder i AC-system, strøm og spænding ikke kun forskellige i deres amplitude, men også i deres fase (φ). Nu er modstanden er ikke længere tilstrækkeligt til at beskrive disse forbindelser. I stedet for komplekse impedans (Z), eller i de fleste tilfælde størrelsen af den impedans (| Z |) anvendes, indeholder den tidligere beskrevne ohmske modstand plus reaktans (X), der retater fra AC strømme gennem kondensatorer og spoler kørsel faseskiftet mellem spænding og strøm 5.
Gælder i AC-kredsløb: | Z (f) | = √ (R2 + X (f) 2)
φ = arctan (X / R)
Når der udføres impedans målinger på intakte celler, på grund af de særlige kendetegn ved deres membran, fungerer celler som en parallel tilslutning af modstand og kondensator. Her modstand repræsenterer modstand strømmen, mens kapacitans (C) beskriver adskillelsen af elektriske bærere på isolerende bi-lag af cellemembranen, der forårsager polarisering af cellen. Derved X er domineret af de kapacitive egenskaber cellemembranen.
X (f) ≈ (2 * Pi * f * C Cell) -1
Da X er frekvensafhængig, variation af den målte frekvens muliggør undersøgelse af forskellige funktionelle og strukturelle egenskaber af cellen. ECIS anordning måler både R og X, muligt at beregneaf | Z |, C og φ.
Kvantificering hele cellelag med impedansspektroskopi Den elektriske ækvivalente kredsløb.
Som tidligere nævnt, når en celle bringes i et elektrisk felt, viser egenskaber af passive elektroniske komponenter. Hvis nu, i stedet for en enkelt celle, et helt cellelag dyrket på toppen af elektroderne, og suppleret med cellekulturmedium undersøges, skal udvides til en hel elektrisk netværk simpel model for modstand og kondensator. I denne såkaldte tilsvarende kredsløb, skal overvejes 3,6 modstand dyrkningsmediet (R Med) samt kapacitans (C elektrisk) og resistens (R elektrisk) at karakterisere interaktionen elektrode / elektrolyt.
En forenklet, generelt eksempel på sådan et ækvivalent kredsløb for en adhærent voksende cellelag kan findes i figur 1.. Fordelen ved en sådan matematisk enMETODE til at beskrive et biologisk system er, at disse kredse kan forfines ad libitum og tilpasset de specifikke eksperimentelle spørgsmål, fx ved at overveje impedans forårsaget af intra-cellulære organeller eller at skelne påvirkninger af celle-celle (R junc) og celle-substrat sammenvoksninger (R Sub) på den samlede impedans 7,8. Ikke desto mindre er det målet, at modellering bør altid være at bruge den mindste række elementer, der beskriver alle funktioner i det målte impedansspektrum at tillade meningsfulde sammenhænge.
Figur 1. Skematisk af ECIS systemet og repræsentativt tilsvarende kredsløb for en vedhængende voksende celler lag. A) Tværsnit af en ECIS kultur godt. Cellerne vokser på toppen af sensing og modelektrode og enre dækket med dyrkningsmedium. Elektroderne er forbundet til en lock-in forstærker og et AC-signal påføres via en 1 MOhm modstand for at skabe en konstant strømkilde. Stimuli kan tilføjes direkte til dyrkningsmediet på ethvert tidspunkt. B) ECIS måler summen af alle individuelle bidrag til impedans. Modstand dyrkningsmediet (R Med) samt impedans forårsaget af elektrode / elektrolyt-grænseflade, som er for nemheds præsenteret som en parallel kombination af en modstand (R elektrisk) og en kondensator (C elektrisk), og også de elektriske egenskaber af cellemembranen, beskrives af en parallelforbindelse af resistens (R Cell) og kapacitans (C Mem), alle har brug for at komme i betragtning. R Cell variabel, da den er afhængig af cellen permeabilitet mod strømmen. Den tilsvarende kredsløb kan udvides og forfinet ad libitum. Som et eksempel forbindelsesepitop (R Junc) somsamt subendotel (R Sub) modstand blev tilføjet til kredsløbet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Impedans parametre og deres biologiske betydning
De to mest direkte parametre afledt fra impedansmålinger er modstand og kapacitans af celler. Modstand repræsenterer kvalitet og funktion af cellen barriere, og derfor tager hensyn til modstand mod para-og trans-cellulær strøm. Kapacitans giver et samlet mål for elektrode dækning. Det karakteristiske træk ved ECIS er, at med hjælp af ækvivalente kredsløb og modellering disse globale parametre giver indsigt i mange flere cellulære egenskaber, herunder celle-celle og celle-substrat sammenvoksninger, som vil blive drøftet senere i denne artikel.
Inden du begynder: Eksperimentel considerationer
Setup Måling – Opsætningen består af flere forskellige dele: ECIS enhed med måling elektronik, PC til dataopsamling, matrix holder til 8 – eller 96-godt-system, ECIS arrays og cellekultur af valg. Vifte Indehaveren skal placeres i en inkubator og forbundet med ECIS enheden uden inkubatoren. Pc'en skal udstyres med ECIS software (1.2.123.0 14 februar 2013), og er forbundet til ECIS enhed.
Array valg – Der er et stadigt voksende udvalg af ECIS arrays, der er designet til mange applikationer. De faste matrixer er 8W1E og 8W10E arrays, som er sammensat af 8 dyrkningsbrønde (angivet med W), der omfatter 1 eller 10 måleelektroder (angivet med E), hhv. En stor counter elektrode fuldender kredsløbet, men dens impedans er hovedsagelig ubetydelig i den egentlige måling 6. Den standard 8-godt-array holder kan rumme to arrays, hvilket resulterer i et samlet antal på 16 dyrkningsbrønde. Guldet elektroder er 50 nm tykt, afgrænset med en isolerende film og monteret på enten et optisk klart Lexan polycarbonat substrat eller et trykt kredsløbskort (PCB). PCB arrays er mere robuste og omkostningseffektiv. De gennemsigtige slides tillader lys og immunofluorescensmikroskopi. Hvad skal overvejes, er, at 1E vifte øger udsving i modstanden signal forårsaget af celle bevægelser og der er behov til sårheling studier. Desuden tillade enkelt elektroder korrelation af elektriske og optiske signaler. I multi elektrode arrays signalet gennemsnit over flere elektroder, der på grund af den øgede måling område omfatter flere celler i målingen, begrænser bias dataene ved ujævn podning og vækst af cellerne og reducerer sløring af signal på grund af celle bevægelser. Derfor multi elektrode arrays er nyttige til at undersøge celleproliferation og barriere formation. Ved siden afstandard arrays der er særlige arrays til rådighed for anvendelsen af forskydningsspænding 9, for at studere kemotaxis 10, celle migration og proliferation samt 96-brønds plader til high throughput screeninger. Konklusionen er, at array, der skal anvendes, er stærkt afhængig af videnskabelig spørgsmål, og celletype og bør udvælges og testes omhyggeligt.
Måling frekvens – Modelleringen af Rb og alfa (se data-analyse) kræver frekvensmålinger multi (MFT). Ellers kan måles impedans over tid på én celletype specifik frekvens (SFT), med den fordel, at data kan indsamles med en højere tidsmæssig opløsning. Den mest følsomme måling frekvens for en specifik celletype kan findes ved frekvens scanninger. Når plotte impedans henholdsvis modstand vs frekvens i en log-log graf, den frekvens, hvor forskellen mellem celle-fri og celle-dækket elektrode største er den frekvens, hvor cellerne blokere than aktuel mest effektivt. I tilfælde af endotelceller (EF) denne frekvens er på omkring 4 kHz.
Podningstæthed – Som i enhver almindelig celle-baserede eksperiment podningstæthed afhænger af den videnskabelige problem. Når man studerer vedhæftning og spredning eller barriere dannelse bør endotelceller seedes med en høj tæthed af 40.000-60.000 celler / cm 2 for at garantere et sammenflydende, stabil barriere efter 48 timer. Hvis fokus af forsøget er på proliferation bør endotelceller podes med en lav densitet på ca 2,000-10,000 celler / cm2.
ECIS er et fremragende værktøj til screening af celle egenskaber og adfærd samt til kvantificering af virkningerne af kendte og ukendte stoffer. Derved cellerne holdes under standard dyrkningsbetingelser kan impedans løbende blive overvåget med en høj tidsmæssig opløsning og korreleret til optiske signaler. På den måde kan vælges det optimale tidspunkt for celle manipulationer på basis af morfologiske og funktionelle celle status. Desværre, denne høje måling opløsning kommer med prisen at små ændringer i temperatur, pH eller mekanisk stimulering af celler (medium ændring) vil påvirke impedanssignalet straks.
Anvendelsen af den lille måling strøm til cellerne gør ECIS måling noninvasive, destruktiv og etiket-fri, men som et resultat kan måles kun passive bioelektriske egenskaber (ingen handling potentialer). Et centralt element er, at en række parametre kan være der ived fra en enkelt måling, kombinere oplysninger fra flere klassiske analyser, ligesom gennemtrængelighed eller sårheling assays. Her særlige interessant aspekt er, at matematisk data kan bruges til at udforske ændringer i modstand og kapacitans og henvise dem til forskellige cellulære strukturer (f.eks celle-kontakter eller cellemembran). Vigtigt at bemærke er, at impedansspektroskopi altid giver et gennemsnit signal fra alle celler på sensorelektroden, som ikke giver mulighed for undersøgelser af enkelte celler, og også den matematiske model er kun gyldigt i sammenflydende cellelag. Derfor endotelceller bør holdes i sammenflydende tilstand i mindst én dag før anvendt til modellering for at sikre modne celle-sammenvoksninger og hvilende celler. Ligeledes bør elektriske sår kun anvendes på sammenflydende cellelag ved hjælp af flere korte sårede pulser med høje frekvenser, for at opnå optimal såret effektivitet og forebygge skader af elektroderne.
jove_content "> For at få den maksimale mængde af information fra en ECIS måling som i hvert assay, flere parametre såsom kombinationen af matrix substrat, belægning og podningstæthed for den enkelte celletype skal testes og optimeres før et eksperiment.En væsentlig begrænsning af ECIS er, at målingen ikke giver direkte oplysninger om det molekylære niveau. Således ECIS målinger er som regel mest informative i begyndelsen af en eksperimentel serie til at hjælpe med at knytte et videnskabeligt problem med cellulære strukturer eller egenskaber, og med betydelige bidrag til dannelsen af et testbare hypotese. Derfor modulære design af ECIS giver et bredt spektrum af applikationer med mulighed for skræddersyede arrays. De seneste array-udvikling tyder på en fremtidig fokus på high throughput impedans screeninger for celledeling og elektrisk såret og forskuddet særlige flow arrays til simulering af in vivo </em> forskydningsspænding med forskellige flow profiler.
Yderligere litteratur
Der henvises endvidere til den webside for Anvendt Biofysik (www.biophysics.com) for applikationseksempler, webinars og en detaljeret liste over publikationer, der dækker hele ECIS spektret.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Charles Keese, Dr. Christian Renken, Christian Dehnert (Applied Biofysik Inc.) og Dr. Ulf Radler (ibidi GmbH) om deres råd, hjælp og de frugtbare drøftelser under udarbejdelsen af dette manuskript. Endvidere vil vi gerne takke Jan van Bezu for hans fremragende teknisk support.