El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
En este protocolo, se describen los métodos eficaces para inhibir genes en líneas celulares de macrófagos de ratón utilizando siRNAs y controlar los efectos de estos tratamientos en la respuesta inmune innata. Estos procedimientos se realizan en formato de 96 pocillos, lo que permite pantallas de RNAi en la moda de mediano o alto rendimiento.
En respuesta a la infección, los seres humanos montar una respuesta inmune innata inmediata y una respuesta inmune adaptativa más lento pero más específico. Esta rápida respuesta inmune innata implica el reclutamiento y la activación de las células inmunes innatas fagocíticas incluyendo macrófagos 1. Macrófagos activados Clásicamente están implicados en las respuestas inflamatorias agudas y producen proteínas antimicrobianas y compuestos, citocinas y quimiocinas, y presentar antígenos 2,3. Macrófagos alternativamente activados desempeñan un papel en la regulación de la inmunidad, el mantenimiento de la tolerancia, la reparación de tejidos, la curación de heridas y 4-8. Debido a su amplia gama de funciones, Los macrófagos pueden desempeñar un papel en numerosas enfermedades, incluyendo la aterosclerosis, artritis, y cáncer 9. Así, el estudio de los macrófagos ha sido un área clave de la investigación durante algún tiempo en una amplia variedad de campos de la enfermedad.
A pesar de su importancia en la respuesta inmune innata, los macrófagos pueden ser un reto para trabajar con células. En particular, es difícil obtener la transfección eficiente utilizando reactivos de lípidos en los macrófagos sin toxicidad asociada 10,11. Además, incluso cuando siRNA se entrega de manera eficiente a los macrófagos, la robustez del gen inducida por RNAi desmontables a menudo puede ser bastante moderado y puede variar de un gen a gen.
Para superar estos desafíos técnicos, hemos optimizado la transfección y técnicas de derribo 12-16 en dos líneas celulares de macrófagos de ratón, RAW264.7 17 y 18 J774A.1. Este enfoque utiliza el sistema de traslado de 96 pocillos Amaxa Nucleofector para la transfección; este sistemautiliza una combinación de reactivos especializados y electroporación para transfectar células en formato de 96 pocillos 19. Después de la transfección, se describen los métodos para maximizar la recuperación celular y la viabilidad y para maximizar la posterior caída de genes inducida por siRNA. Para ilustrar la utilidad de este enfoque, se describe un protocolo para la entrega siRNA a estas líneas celulares de macrófagos, estimular estas células con lipopolisacárido (LPS), y controlar la respuesta inmune innata en el nivel de producción de varias citocinas pro-inflamatorias. Proporcionamos datos de la muestra en la que se dirigen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR), cuyos miembros detectar LPS y otros patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs), para regular la inmunidad innata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Numerosos estudios han sido publicados en los que los genes individuales han sido blanco de siRNA en macrófagos murinos. Mientras que la transfección mediada por lípidos ha sido utilizado para entregar siRNA a las líneas celulares de macrófagos sobre una base individual, estos métodos sufren de los efectos potenciales sobre la viabilidad, la caída limitada de genes, y la variabilidad del gen a gen. Para desarrollar ensayos más robustos que podrían ser utilizados para apuntar a genes de la moda de mediano o de a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
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