Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Summary

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Abstract

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Introduction

I denne protokollen beskriver vi effektive metoder for å hemme gener i mus makrofagcellelinjer hjelp sirnas og overvåke effekten av disse behandlingene på det medfødte immunresponsen. Disse fremgangsmåtene blir gjennomført i 96-brønners-formatet, slik at for RNAi skjermer i middels- eller høy-throughput måte.

Som reaksjon på infeksjon, mennesker montere en umiddelbar medfødte immunrespons og en langsommere, men mer spesifikk adaptiv immunrespons. Denne raske medfødte immunrespons innebærer rekruttering og aktivering av fagocytterende medfødte immunceller inkludert makrofager ^1. Klassisk aktiverte makrofager er involvert i akutte inflammatoriske responser og produsere antimikrobielle proteiner og forbindelser, cytokiner og chemokiner, og presentere antigener ^2,3. Alternativt kan aktiverte makrofager spiller en rolle i regulering av immunitet, opprettholde toleranse, vevsreparasjon og sårheling ^4-8. På grunn av deres brede spekter av funksjonerKan makrofager spiller en rolle i en rekke sykdommer som aterosklerose, artritt, og kreft ^9. Således har studiet av makrofager vært et sentralt område av forskning i noen tid i et bredt utvalg av sykdoms felt.

Til tross for sin betydning i det medfødte immunrespons, kan makrofager være utfordrende celler å jobbe med. Spesielt er det vanskelig å oppnå effektiv transfeksjon ved hjelp av lipid reagenser i makrofager uten assosiert toksisitet ^10,11. Dessuten, selv når siRNA er effektivt leveres til makrofager, kan robustheten av RNAi-induserte genet knockdown ofte være relativt moderat, og kan variere fra genet til genet.

For å overvinne disse tekniske utfordringer, har vi optimalisert transfeksjon og knockdown-teknikker ^12-16 i to muse makrofagcellelinjer, RAW264.7 ¹⁷ og J774A.1 ^18. Denne tilnærmingen bruker Amaxa Nucleofector 96 brønner Shuttle System for transfeksjon; Dette systemetbruker en kombinasjon av spesialiserte reagenser og elektroporering for å transfektere celler i 96-brønners format ^19. Etter transfeksjon beskriver vi metoder for å maksimere celle utvinning og levedyktighet og for å maksimere påfølgende siRNA-indusert genet knockdown. For å illustrere nytten av denne tilnærmingen, beskriver vi en protokoll for siRNA levering til disse makrofagcellelinjer, stimulere disse cellene med lipopolysakkarid (LPS), og overvåke den medfødte immunrespons ved nivået for produksjon av flere pro-inflammatoriske cytokiner. Vi gir eksempler data der vi målet Toll-like receptor (TLR) familie, hvis medlemmer forstand LPS og andre patogen assosiert molekylære mønstre (PAMPs), å regulere medfødt immunitet.

Protocol

1. Opprettholdelse av makrofagcellelinjer Dyrk RAW264.7 og J774A.1 cellelinjer i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO2. Å bidra til å opprettholde sterilitet, tilsett 1% penicillin / streptomycin (penn / strep) til media (selv om dette er strengt tatt ikke nødvendig). Kritisk trinn: Pass på at makrofagene vokser i en sunn tilstand for effektiv transfeksjon og siRNA-indusert genet knockdown. Bruk celler mellom passasjene 3 og…

Representative Results

For å demonstrere effektiviteten av transfeksjon ved bruk av denne tilnærmingen, overvåket vi opptaket av FITC-merket siRNA ved hjelp av et strømningscytometer (figur 1). For å illustrere nytten av vår tilnærming for overvåking av medfødte immunrespons, vi transfektert sirnas rettet kjente medfødte immun regulatoriske gener inn i RAW264.7 makrofagcellelinje, stimuleres cellene med LPS, og deretter overvåket produksjonen av proinflammatoriske cytokiner IL- 6 og TNF…

Discussion

Tallrike studier har blitt publisert i den enkelte gener har blitt målrettet av siRNA i murine makrofager. Mens lipid-mediert transfeksjon har vært brukt til å levere siRNA til makrofagcellelinjer på individuell basis, er disse fremgangsmåter lider av potensielle virkninger på levedyktighet, begrenset gen knockdown, og variasjon fra genet til genet. Å utvikle mer robuste analyser som kan brukes til å målrette gener i middels eller høy gjennomstrømming mote, vi optimalisert teknikker som bruker Amaxa Nucleofec…

Materials

Amaxa nucleofector 96-well shuttle system	Lonza	AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit	Lonza	V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-67
siGenome smartpool siRNA	Dharmacon	varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool	Dharmacon	D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electrooration	Invitrogen	13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS	List Biological Laboratories	421
DMEM, high glucose	Invitrogen	11995-065
RPM1-1640	Invitrogen	11875-093
Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep)	Fisher	SV30010
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
96 well tissue culture plates	Fisher	07-200-89
96 well round bottom sterile plates (not coated)	Fisher	07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY406
Mouse TNFa Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY410
Fluorescein diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
RLT Bufer	Qiagen	79216
Rneasy mini kit	Qiagen	74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit	Invitrogen	V-6694