세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구
Summary
재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.
Abstract
침윤성 암은 전이에 인접 조직과 성향의 침입을 특징으로 악성 상피 종양의 그룹입니다. 암세포 및 그들의 미시 사이에서 신호의 상호 작용은 유방암의 성장 및 생물학적 행동 하나에 강력한 영향을 미친다. 그러나, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서이 신호의 대부분은 손실되거나 세포가 단층으로 두 가지 차원의 문화 (2D)에서 재배 할 때의 관련성은 understudied 아르됩니다. 최근, 재구성 기저막의 입체 (3D) 문화는 양성 및 악성 유방 세포의 조직 구조를 다시 요약 선택의 방법으로 떠오르고있다. 3D에서 자란 세포는 세포 외 기질에서 중요한 단서를 유지하고 생리학 관련 생체 시스템 2,3을 제공합니다. 참고로, 제 4에 비해 3D로 성장하면 세포가 다르게 행동 것을 제안 성장하는 증거가있다. 3D 문화효과적으로 3 개인 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별하는 수단으로하고 세포 및 분자 시그널링을 뒷받침 위해 사용될 수있다. 양성 상피 세포의 구별되는 특징 중 하나는 꼭대기 세포질은 루멘으로하고 기초 세포질이 기저막에 달려있다 그래서 그들은 편광되는 것입니다. 이 apico – 기초 극성은 세포의 해체와 우연히 주변의 기질에 침투 세관을 anastomosing 및 분기의 형성을 특징으로 침윤성 암에 손실됩니다. 양성 선 및 침윤 암 사이의 이러한 조직 병리학 적 차이는 3D 6,7에서 재현 할 수 있습니다. 다른 분자 및 세포 생물학 기술, 3 차원의 cultur와 함께 세포 증식, 극성 및 세포 사멸에 대한 검증 분자 마커의 발현을 차등 한 라운드 선포 구조의 정량과 같은 적절한 읽기 아웃을하거나 사용전자 나은 악성 변환시와 책임 신호를 서술의 세포 변화를 이해하는 중요한 도구를 제공 할 수 있습니다.
Introduction
재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 (3D)는 복잡한 표현형 정상 유방과 유방암 2,3의 관련 신호를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 유방의 기능 단위는 꽈리에있는 나뭇 가지의 작은 관으로 구성 터미널 덕트 소엽 단위 (TDLU)입니다. 선포 세포는 기저막 (5)에 의해 둘러싸여있다 두 세포층, 상피 및 근 상피 세포로 구성된 매우 조직 구조이다. 일반 선포 세포의 가장 두드러진 특징은 휴대 편광, 기본 기저막에 부착 전문 세포 – 세포 연락처입니다. 이 복잡한 조직은 침략 암에 중단됩니다. 세포는 단층으로 재배되는 널리 사용되는 2 차원의 문화, 선포 세포의 형성을 허용하지 않습니다. 따라서, 단층 배양 상피 세포 간의 복잡한 관계를 캡처하는 시스템을 제공 부족정상 유방과 유방암에서의 규제 완화. 유방 세포의 기능 monotypic 상피 문화는 여러 실험실 2,3에서 개발되었다. 3D 배양 Engelbreth-홀름 – 스웜 마우스 육종 세포 유래 가용화 엑기스이며 시판되고 리겔에 유방암 세포의 성장을 포함한다. 콜라겐 같은 다른 3D 하층은 I도 사용된다. 유방 세포는 세포가 매트 리겔이에 매립 배양 3D 임베디드 분석법에 의해 3 차원으로 배양 할 수있다. 또한, 세포는 또한 리겔의 적은 양을 필요로하고, 위상 콘트라스트 이미지에 의해 콜로니 형성의 시간 경과 감시를 용이하게하고 현장 영상 2에 이상적입니다로 비용 효과적인 3D 오버레이 분석,라고, 최고 분석에 3D로 배양 될 수있다 -3. 베스트 분석에 3D는 선포 표현형 및 유전자 발현 프로파일 (7) 사이의 상호 관계를 정의하는 데 사용되었다.
3D 문화 effectiv 할 수 있습니다엘리 침윤 암에서 정상과 양성 세포를 구별하는 데 사용됩니다. 정상 및 양성 유방 세포가 침윤 암 세포가 루멘없이 청소와 다산과 우연히 성장하는 반면 성장이 리겔의 중심에있는 잘 정의 된 루멘 편파 구조를 체포 형성한다. E6/E7은 인간의 유방 상피 세포와 섬유 낭종 성 변화와 36 세 환자에서 분리 된 자발적 불후의 세포주가 성공적으로 3D 3.8에 양성 유방 표현형을 탈환하는 데 사용되었습니다 및 지낸입니다 MCF10A 세포주를, 불후의 여러 분자 8,9의 종양 및 종양 억제 기능을 연구하기위한 모델 시스템. 이러한 양성 세포는 렌티 바이러스 / 레트로 바이러스의 도입으로 그 유전자 (들)을 조작 할 수 있도록 설계 할 수있다. 관심의 유전자 (들)은 종양 억제 경우 그 유전자가 양성 세포의 발암 유전자 과발현 경우, shRNA를 매개 최저는 반면 악성 변화로 이어질 것악성 표현형을 표시해야합니다. 두 경우 모두 3D로 형성된 선포 구조는 악성 변화를 캡처 할 수 있습니다.
3D로 도금 양성 단일 세포는 구형 구조를 증식 원형 형성하기 시작합니다. 일 5-8 셀이 구형 집합체 마트 리겔과 접촉하는 세포의 주변 편광 층 및 마트 리겔과 접촉이없는 적은 편광 세포의 내측 질량으로 분화한다. 다음 10-15 일에서 내부 세포 사멸이 명확한 루멘을 형성하여 죽기 시작합니다. 악성 세포는 우연히 자신의 극성을 잃고 성장할 것입니다. 고도의 악성 세포는 일반적으로 구조를 분기 형성한다. 표현형의 이러한 차이는 시간 경과 위상 콘트라스트 이미지에 의해 현장에서 관련 분자 마커로 면역 염색에 의해 캡처 할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 마커는 증식 마커 포스 포 히스톤 3 apoptot와 조합하여, 알파 -6 – 인테그린, 기저 극성 마커 아르IC 마커는 카스파 제 3을 절단. 후자 꽈리의 중심 정상적인 양성 유방 세포의 기능에 루멘을 형성가 있는지를 결정하는 것이 중요하다. 다른 극성과 세포 – 세포 접촉 마커 GM130, 라미닌, ERM, E-cadherin의 (가) 있습니다. 교대 유방암 세포주 관심 유전자를 조작하기 위하여 설계 될 수있다. 체포 더 성장이 경우 복귀 양성 표현형으로 사용할 수 암 표현형을 구별 할 독출.
3D 문화는 신중 악성 변형 10-11에 관련된 신호 전달 경로를 묘사하는 데 사용할 수 있습니다. 사용하여 위의 읽기 아웃, 약물 억제제, 차단 항체 나 재조합 단백질을 언급하는 것은 악성 변화를 선도하는 분자 신호에 정확하게 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 지속적인 노력으로는 RNA를 분리하고 또한 면역 블롯 및 면역에 해물을 준비하는 차원에서 세포를 추출 할 수noprecipitation. 이러한 전략은 프로토콜 단계적 상세한 방법에 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에서 재구성 기저막에 유방 상피 세포의 세 가지 차원의 문화와 악성 대 양성 유방 표현형을 구별하는이 시스템의 유용성을 설명했다. 이 시스템은 또한 다른 선의 조직 배양에서 다른 세포 유형에 이용 될 수 있고, 성공적으로 12-14 몇 가지 이름을 배양 전립선 상피 기관지 상피 및 갑상선 상피 세포에 사용 된 것으로보고되었다. 3D 배양의 중요성은 생리 학적으로 관?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R01 CA107469, R01 CA125577 및 CG KLEER, 미시간의 암 센터 지원 대학에 U01CA154224에 의해 지원되었다.
Materials
| Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
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