Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Summary

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Abstract

Veel eiwitten interageren tijdelijk met andere eiwitten of geïntegreerd in multi-eiwitcomplexen hun biologische functie. Bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) is een in vivo methode om dergelijke interacties in plantencellen te monitoren. In de gepresenteerde protocol de onderzochte kandidaat eiwitten worden gefuseerd aan complementaire helften van fluorescerende eiwitten en de respectievelijke constructen worden geïntroduceerd in planten cellen via door Agrobacterium gemedieerde transformatie. Vervolgens worden de proteïnen tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren en herstelde fluorescente signalen worden gedetecteerd met een confocale laser scanning microscoop in intacte cellen. Dit maakt niet alleen visualisatie van de interactie zelf, maar ook de subcellulaire lokalisatie van het eiwit complexen kan worden bepaald. Hiertoe kan merkergenen die een fluorescerend label worden tezamen tot expressie gebracht met de BiFC constructen, waardoor cellulaire structuren zoals t visualiserenhij endoplasmatisch reticulum, mitochondriën, het Golgi-apparaat of de plasmamembraan. De fluorescerende signaal kan worden bewaakt direct epidermale bladcellen of enkele protoplasten, die gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd uit de getransformeerde tabaksbladeren. BiFC is bij uitstek geschikt om eiwit-eiwit interacties te bestuderen in hun natuurlijke omgeving in de levende cel. Er moet echter worden aangenomen dat de expressie moet worden door sterke promoters en de interactiepartners gemodificeerd door fusie van de relatief grote fluorescentie labels, die kunnen interfereren met de interactie mechanisme. Niettemin BiFC een uitstekende complementaire aanpak van andere algemeen toegepaste methoden onderzoeken eiwit-eiwit interacties, zoals co-immunoprecipitatie, in vitro pull-down tests of gist-twee-hybride experimenten.

Introduction

Het bestuderen van de vorming van eiwitcomplexen en hun lokalisatie in plantencellen in vivo is essentieel voor cellulaire netwerken onderzoeken, signalering en metabole processen. BiFC maakt visualisatie van eiwit-eiwit interacties in hun natuurlijke milieu zijn in het levende plantencel ^1-5.

In de BiFC benadering de complementatie van twee niet-fluorescerende N-en C-terminale fragmenten van een fluorescerend eiwit leiden tot een opnieuw fluorescerend eiwit. Fragmenten van verschillende fluorescerende eiwitten zijn gebruikt om eiwit interacties te detecteren, bijvoorbeeld het groen fluorescent eiwit (GFP) de chromofoor waarvan chemisch gevormd door drie verschillende resten ^6. Fluorescente eiwitten kunnen worden gehalveerd binnen een lus of ß-streng leiden tot twee niet-fluorescerende fragmenten die kunnen worden gefuseerd aan twee eiwitten van belang. De test kan worden gebruikt om interacties te detecteren in elk subcellulaire compartimnt in elk aëroob kweken organisme of cellen die genetisch kunnen worden gemodificeerd om de fusie-eiwitten tot expressie. Als de twee eiwitten zijn in dichte nabijheid in de cel, wordt fluorescentie gereconstitueerd en kan worden gecontroleerd door microscopisch zonder toevoeging van exogeen fluoroforen of kleurstoffen ^3.

Tabak (Nicotiana benthamiana) heeft bewezen een geschikte modelorganisme de interactie van eiwithoudende visualiseren, aangezien vormen gemakkelijk door gebruik Agrobacterium-gemedieerde transformatie van tabaksbladeren met de gegenereerde constructen kan worden uitgedrukt. Agrobacterium gebruik een zogenaamde Ti-plasmide (tumor-inducerende) coderen voor enzymen die de transductie van het gen van interesse in plantencellen mediëren. BiFC is goed toepasbaar voor oplosbare en voor membraaneiwitten in cellulaire compartimenten en is met succes gebruikt in de afgelopen jaren identificeren interagerende eiwitten in vivo alsook interactieplaatsen analyserenbinnen de eiwitten ^7-9. Bij expressie van de ingebrachte genen, kan de interactie van de fluorescerende eiwitten direct worden gevisualiseerd in bladeren, die geschikt is voor grotere cellulaire structuren, zoals het endoplasmatisch reticulum (ER), de plasmamembraan of chloroplasten. Echter, de lokalisatie in meer verfijnde structuren controleren, bijvoorbeeld de chloroplast envelop, is het raadzaam om de fluorescentie te visualiseren in protoplasten geïsoleerd uit getransformeerde tabaksbladeren. Een reeks BiFC vectoren die ofwel een C-terminal of N-terminale fluorescente label moet worden gebruikt voor de BiFC benadering in planten ^10. Het hieronder beschreven protocol werd gebruikt om de interactie van cytosolisch heat shock eiwit 90 (HSP90) bestuderen de tetratricopeptide repeat (TPR) domein bevattende eiwitten docking Toc64 en AtTPR7 die in de chloroplast buitenomhulling en het endoplasmatisch reticulum, respectievelijk ^11-13. Hiertoe werd HSP90 gefuseerd aan de Cterminal deel van SCFP (SCFP ^C). Het label werd N-terminaal gefuseerd aan de chaperon toegankelijkheid van de C-eindstandige MEEVD bindende motief van HSP90 TPR domeinen type klemmen garanderen. Tegelijkertijd werd het N-terminale deel van Venus (Venus ^N) gefuseerd aan het cytosolische domein van het TPR-domein bevattende eiwitten docking Toc64 en AtTPR7 respectievelijk. Als negatieve controle wij gekloneerd de oplosbare C-terminale deel van SCFP ^C uitsluitend is onderdeel van het cytosol en daarom een geschikte controle.

De fluorescerende tags van de onderzochte eiwitten aan dezelfde cellulaire compartiment oog in nabijheid en daardoor reconstitutie van het fluorescentiesignaal mogelijk. Om de lokalisatie van de gereconstitueerde fluorescentiesignaal markerproteïne gefuseerd aan een ander fluorescerend label kan worden gecotransformeerd de subcellulaire lokalisatie van de interactie demonstreren bepalen. Een ER marker eiwit gefuseerd mCherrry werd gelijktijdig getransformeerd in deBij het ​​ER gelegen AtTPR7 ^14. De autofluorescentie van chlorofyl diende als chloroplast marker in het geval van Toc64. Door dit niet alleen de in vivo interactie van Toc64 en AtTPR7 respectievelijk de cytosolische HSP90 chaperon kan direct worden gecontroleerd in tabaksbladeren maar ook de subcellulaire lokalisatie van de interactie kan worden onderzocht.

BiFC is goed geschikt als aanvullende benadering van andere methoden bestuderen van eiwit-eiwit interacties. Vergeleken met co-immunoprecipitatie of in vitro pull-down experimenten, bijvoorbeeld, geen specifieke antilichamen beschikbaar zijn voor de eiwitten van belang, en de eiwitten niet te recombinant worden uitgedrukt in vitro, die lastig zijn, vooral voor membraaneiwitten. Bovendien ook voorbijgaande interacties worden gevolgd met BiFC, aangezien de eiwitten weergegeven door de interactie van de gefuseerde fluorescente markeringen ^15.

Protocol

1. Transformatie van BiFC constructen Agrobacteria Klonen van BiFC constructen Versterken het gen van belang uit een geschikt sjabloon gebruiken oligonucleotiden die flankerende attB-sites. Voer een PCR met behulp van een corrigerend polymerase. Pas de lengte van de uitgloeistap de ontworpen primer combinatie en de lengte van het rek stap volgens de fragmentgrootte. Controleer het PCR-product door agarosegelelektroforese en zuiveren met behulp van een PCR Clean-up Kit. Voer de BP reactie me…

Representative Results

In dit voorbeeld hebben we het BiFC methode om de interactie van de cytosolische moleculaire chaperon HSP90 met membraan docking eiwitten AtTPR7 en Toc64 controleren. AtTPR7 is onderdeel van de Sec translocon en de wisselwerking met cytosolische chaperones, die eventueel leveren uitscheiding preproteins voor post-translationele translocatie naar het ER membraan. Ook Toc64 bij de chloroplast buitenste omhulling handelt in post-translationele import door het ontvangen van HSP90 geassocieerd chloroplast preproteins. Beide …

Discussion

Bij het plannen van een BiFC experiment een aantal punten moet worden beschouwd. Hoewel geen structurele informaties eiwitten van belang vereist, de topologie bekend bij het werken met membraan-overspannende eiwitten. De fluorescerende eiwitten moeten zich in dezelfde subcellulair compartiment of staan ​​voor dezelfde zijde van een membraan interactie mogelijk. Natuurlijk, bij het analyseren eiwitten die een N-terminale targeting sequentie nodig, maar alleen een C-terminaal tag kan worden beschouwd. Omdat het mogeli…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)