रिजनरेटिव रिसर्च के लिए सुरीले नैनोकणों
Summary
प्रोटोकॉल विवरण दूसरी हार्मोनिक पैदा नैनोकणों के साथ इन विट्रो लेबलिंग मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रदान की जाती हैं. बहु photon माइक्रोस्कोपी और हृदय समूहों में उनके भेदभाव से hESC जांच के लिए तरीके भी प्रस्तुत कर रहे हैं.
Abstract
इस कल्पना की प्रयोग में, प्रोटोकॉल विवरण दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी नैनोकणों (HNPs) के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो लेबलिंग (hESC) के लिए प्रदान की जाती हैं. उत्तरार्द्ध हाल ही में बहु फोटॉन इमेजिंग के लिए जैविक नमूने लेबलिंग के लिए शुरू की जांच की एक नई परिवार हैं. HNPs उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर कोई प्रतिबंध के साथ दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी के nonlinear ऑप्टिकल प्रक्रिया द्वारा उत्तेजना प्रकाश की आवृत्ति को दोगुना करने में सक्षम हैं.
बहु फोटान (लंबी अवधि हवा तरल संस्कृतियों के रूप में बनाए रखा) हृदय समूहों में hESC भेदभाव के तरीके के आधार पर विस्तार से प्रस्तुत कर रहे हैं. विशेष रूप से, 3 डी में हृदय ऊतक पिटाई की 3 डी निगरानी के दौरान अलग HNPs की तीव्र दूसरी हार्मोनिक (एसएच) के उत्सर्जन को अधिकतम करने के बारे में सबूत दिखाया गया है. 3 डी विस्थापन पैटर्न को पुनः प्राप्त करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवियों का विश्लेषण भी विस्तृत है.
Introduction
Nonlinear माइक्रोस्कोपी प्रणाली, अपने निहित तीन आयामी सेक्शनिंग क्षमताओं के लिए धन्यवाद, तेजी से लगभग अवरक्त में दो photon अवशोषण बैंड के साथ फोटो स्थिर fluorophores के लिए मांग शुरू हो रहा है. केवल वर्ष के पिछले कुछ में, प्रतिदीप्ति आधारित लेबल (रंजक, क्वांटम डॉट्स, ऊपर से परिवर्तित नैनोकणों), एक अलग इमेजिंग पद्धति लेबल के रूप में स्वाभाविक nonlinear नैनोकणों के एक उपन्यास परिवार के उपयोग का शोषण किया गया है, यानी के विकास के पूरक हैं विशेष रूप से बहु photon माइक्रोस्कोपी के लिए विकसित किया गया है जो हार्मोनिक नैनोकणों (HNPs). अकार्बनिक noncentrosymmetric क्रिस्टल के आधार पर ये लेबल, उत्तेजना आवृत्ति की एसएच पैदा ऑप्टिकल विपरीत डालती: निकट अवरक्त स्पंदित उत्तेजना प्रकाश का एक अंश में कनवर्ट करके उदाहरण के लिए दिखाई नीले प्रकाश में (λ = 800 एनएम) (λ / 2 = 400 एनएम) . हाल के दिनों में कई लेखकों लोहा iodate फे (आईओ सहित विभिन्न सामग्रियों का परीक्षण किया <sub> 3) 3 1, पोटेशियम niobate (KNbO 3) 2, लिथियम niobate (LiNbO 3) 3, बेरियम titanate (BaTiO 3) 4,5, पोटेशियम Titanyl फॉस्फेट (KTiOPO4, KTP) 6-8, और जिंक आक्साइड (ZNO ) 5,9,10. फ्लोरोसेंट जांच की तुलना में, HNPs जैसे पूरी विरंजन के अभाव और निमिष, संकीर्ण उत्सर्जन बैंड, (अवरक्त से पराबैंगनी) उत्तेजना तरंगदैर्ध्य tunability, अभिविन्यास पुनः प्राप्ति की क्षमता, और सुसंगत ऑप्टिकल प्रतिक्रिया के रूप में आकर्षक गुणों की एक श्रृंखला होती है. इन अद्वितीय गुण हाल ही में दो व्यापक समीक्षा के कागजात 11,12 में समझाया गया है. इसके अलावा, बिखरने और अवशोषण को कम करके इमेजिंग गहराई बढ़ जाती है जो अवरक्त वर्णक्रम क्षेत्र में काम करने की संभावना काफी नमूना फोटो गिरावट 13,14 सीमा. इसके अलावा, HNPs द्वारा गारंटी असीम रूप से फोटो स्थिर संकेत लंबे समय तक सेल ट्रैकिंग के लिए उन्हें आदर्श जांच, जो बनाता है मैंविशेष रूप से पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों 15 के लिए अपील कर रही है.
इस कल्पना की प्रयोग में, प्रोटोकॉल विवरण unfunctionalized HNPs साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो लेबलिंग (hESC) के लिए प्रदान की जाती हैं. कोलाइडयन निलंबन के संश्लेषण और तैयारी पिछले एक प्रकाशन में और उसमें संदर्भ 16 में विस्तृत है और इस काम के दायरे से परे है. (लंबी अवधि हवा तरल संस्कृतियों के रूप में बनाए रखा) हृदय समूहों में बहु photon माइक्रोस्कोपी और उनके भेदभाव से hESC जांच के लिए तरीके में प्रस्तुत कर रहे हैं. मानव ईएससी निलंबन में कॉलोनी के टुकड़े की ईबी गठन के द्वारा या चित्र 1 ए में सचित्र के रूप में, वैकल्पिक रूप से, Aggrewell प्लेट का उपयोग ईबीएस में एकल कक्षों के एकत्रीकरण के लिए मजबूर या तो दो अलग अलग तरीकों, में तथाकथित embryoid निकायों (ईबीएस) के भीतर अंतर करने के लिए जाने जा सकते हैं . polytetrafluoroethylene पर हृदय कोशिकाओं के समूहों पिटाई संवर्धन (PTFE) झरझरा फिल्टर कारकोंआगे की पढ़ाई (कार्रवाई क्षमता के उदाहरण के लिए electrophysiological माप) के लिए अपने लंबी अवधि के रखरखाव ilitates.
स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की उत्तेजना स्रोत HNPs की दूसरी हार्मोनिक इमेजिंग प्रदर्शन करने की जरूरत सत्ता शिखर तक पहुंचने के लिए (नमूना पर 300 FSEC से छोटी एक नाड़ी की अवधि के साथ) ultrashort दालों देने में सक्षम होना चाहिए. उदाहरण के लिए, इमेजिंग के लिए सबसे आम उपयोग FSEC स्रोत tunable तिवारी हैं: नीलम लेज़रों. नीलमणि पंप अवरक्त ऑप्टिकल पैरामीट्रिक Oscillators: वैकल्पिक रूप से, अन्य ultrafast पराबैंगनीकिरण उदाहरण अर्बियम आयन 17, क्रोम forsterite 18 या तिवारी के लिए नियोजित किया जा सकता है. माइक्रोस्कोप अधिमानतः एक नहीं बल्कि उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य के साथ सुसज्जित किया जा सकता है. बहुत महत्वपूर्ण, पिछले माप, और उद्देश्य बदल दिया जाता है हर समय के लिए, यह काम पर लेजर पल्स पूर्व कंप्रेसर की सेटिंग्स को अनुकूलित करके सेट अप (लेंस) में फैलाव उपस्थित कम करने के लिए अनिवार्य हैचुनाव की तरंग दैर्ध्य. प्रोटोकॉल में विस्तृत इस प्रक्रिया, लेजर पल्स फोकल हवाई जहाज़ पर सीमित अवधि को बदलने (यानी कम से कम संभव के रूप में) करने के लिए संभव के रूप में बंद है और नमूना nonlinear प्रतिक्रिया है कि अधिकतम सुनिश्चित करता है.
प्रोटोकॉल के अंत में वर्णित छवि विश्लेषण के लक्ष्य की पहचान करने और हृदय समूहों पिटाई की लयबद्ध संकुचन के साथ जुड़े 3 डी HNPs आंदोलनों में ट्रैक करने के लिए है. छवि विमान में ट्रैकिंग नैनोकणों बस लगातार फिल्म फ्रेम में अपने पदों की पहचान के द्वारा एहसास हो रहा है. अक्षीय आंदोलन पर जानकारी निकालने के लिए, अक्षीय विस्थापन के एक समारोह के रूप में nonlinear तीव्रता प्रतिक्रिया की पूर्व अंशांकन अनिवार्य है. लंबी अवधि के माप, नमूना अक्षीय स्थिति के एक सक्रिय interferometric नियंत्रण के लिए ध्यान दें कि थर्मल और / या यांत्रिक drifts की उपस्थिति में अंशांकन वक्र की वैधता बनाए रखने के लिए आवश्यक है.
Trac को यहां इस्तेमाल HNPsसमुच्चय के भीतर ई पिटाई कोशिकाओं niobate पोटेशियम ऑक्साइड (KNbO 3) पर आधारित हैं, लेकिन अन्य उपलब्ध nonlinear nanomaterials के Staedler एट अल 16 के काम में विस्तार से समीक्षा कर रहे हैं.
अब तक की जांच की nanomaterials के अधिकांश के nonlinear ऑप्टिकल क्षमता बहुत तुलना कर रहे हैं. KNbO 3 के लिए चुनाव अनिवार्य रूप से कोलाइडयन समाधान का अच्छा स्थिरता और यहां तक कि काफी उच्च एकाग्रता और लंबे प्रदर्शनी बार 16 में कई मानव कोशिका लाइनों पर परीक्षण अपनी अच्छी biocompatibility, से प्रेरित था.
इस कार्य के लिए नियोजित nanomaterial की नवीनता को देखते हुए, फ्लोरोसेंट / luminescent जैव मार्करों की तुलना में HNPs की मुख्य विशेषताओं लेखकों द्वारा एहसास एक छोटी मूल कंप्यूटर वीडियो एनीमेशन में दिखाया गया.
Protocol
Representative Results
Discussion
स्टेम सेल अनुसंधान के लिए नैनो का आवेदन एक अपेक्षाकृत नया है, लेकिन तेजी से विस्तार क्षेत्र है. इस विषय पर विभिन्न समीक्षा लेख से कहा, नैनोकणों के उपयोग से कम नहीं रचना की, प्रोटीन और जीन के intracellular वितरण कर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों यूरोपीय FP7 अनुसंधान परियोजना NAMDIATREAM (NMP4 ला 2010-246479, http://www.namdiatream.eu) और INTERREG चतुर्थ फ्रांस-स्विट्जरलैंड नाओमी परियोजना से आंशिक धन स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37°C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | CFI Plan Fluor 10x | NA 0.30, WD 16 mm |
| CFI Plan Apo 20x | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40x | NA 1.25, WD 0.18mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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