Harmonique nanoparticules régénératrice recherche
Summary
Détails du Protocole sont prévus pour l'étiquetage des cellules souches in vitro d'embryons humains à des nanoparticules deuxième engendrent des harmoniques. Méthodologies d'enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques sont également présentés.
Abstract
Dans cette expérience visualisée, les informations de protocole sont fournies pour le marquage in vitro de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) avec des nanoparticules de seconde génération harmonique (HNPs). Ces derniers sont une nouvelle famille de sondes introduites récemment pour l'étiquetage des échantillons biologiques pour l'imagerie multi-photonique. HNPs sont capable de doubler la fréquence de la lumière d'excitation par le processus optique non linéaire de génération de seconde harmonique sans restriction sur la longueur d'onde d'excitation.
Multi-photon méthodes de différenciation des CSEh en grappes cardiaques (maintenues comme cultures de l'air liquide longue durée) en fonction sont présentés en détail. En particulier, les données sur la façon de maximiser la seconde harmonique (SH) émission intense de HNPs isolés pendant le suivi 3D de battre le tissu cardiaque en 3D s'affiche. L'analyse des images obtenues à récupérer des modèles de déplacement 3D est également détaillée.
Introduction
Systèmes de microscopie non linéaire, grâce à leurs trois capacités inhérentes de coupes dimensions, sont de plus déclenché la demande de fluorophores avec des bandes d'absorption à deux photons photo-stable dans le proche infrarouge. Seulement dans les deux dernières années, afin de compléter le développement de labels basés sur la fluorescence (colorants, les points quantiques, jusqu'à conversion nanoparticules), une méthode d'imagerie différente a été exploite l'utilisation d'une nouvelle famille de nanoparticules intrinsèquement non linéaires comme des étiquettes, à savoir nanoparticules harmoniques (de HNPs) qui ont été spécifiquement développés pour la microscopie multi-photons. Ces étiquettes, à base de cristaux non-centrosymétriques inorganiques, exercent contraste optique générant le SH de la fréquence d'excitation: par exemple en convertissant une fraction de la lumière d'excitation pulsée dans le proche infrarouge (λ = 800 nm) en lumière bleue visible (λ / 2 = 400 nm) . Plusieurs auteurs dans le passé récent ont testé différents matériaux, y compris iodate de fer Fe (IO <sub> 3) 3 1, le niobate de potassium (KNbO 3) 2, le niobate de lithium (LiNbO 3) 3, du titanate de baryum (BaTiO 3) 4,5, phosphate de potassium titanyle (KTiOPO4, KTP) 6-8, et de l'oxyde de zinc (ZnO ) 5,9,10. Par rapport à des sondes fluorescentes, HNPs possèdent une série de propriétés intéressantes, telles que l'absence complète de blanchiment et clignotant, des bandes d'émission étroites, l'excitation d'onde accordabilité (de l'ultraviolet à l'infrarouge), la capacité de récupération de l'orientation, et la réponse optique cohérente. Ces propriétés uniques ont été récemment expliqué dans deux articles de synthèse complet 11,12. La possibilité de travailler dans le domaine spectral infrarouge, ce qui augmente la profondeur d'imagerie en réduisant au minimum la diffusion et l'absorption, limite également considérablement la dégradation de l'échantillon photo 13,14. En outre, le signal infiniment de photo-stable garanti par HNPs fait des sondes idéales pour le suivi des cellules à long terme, qui is particulièrement attrayant pour des applications en médecine régénérative 15.
Dans cette expérience visualisée, les informations de protocole sont fournies pour le marquage in vitro de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) avec HNPs non fonctionnalisés. La synthèse et la préparation des suspensions colloïdales est détaillée dans une publication précédente et dans les références qui y sont 16 et est au-delà de la portée de ce travail. Méthodologies d'enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques (maintenues comme cultures de l'air liquide à long terme) sont présentés. ESC humain peut être laissé à la différence dans les corps embryoïdes dits (EBS) de deux façons différentes, soit par la formation EB de fragments de colonies en suspension ou, à défaut, forcés agrégation de cellules individuelles dans EB utilisant la plaque Aggrewell, comme illustré sur la figure 1A . mise en culture de battre des amas de cellules cardiaques de polytétrafluoroéthylène (PTFE) filtres poreux facilitates leur maintien à long terme pour d'autres études (par exemple des mesures électrophysiologiques de potentiels d'action).
La source du microscope à balayage d'excitation doit être capable de délivrer des impulsions ultracourtes (avec une durée d'impulsion inférieure à 300 fs à l'échantillon) pour atteindre la puissance crête nécessaire pour effectuer l'imagerie de seconde harmonique de HNPs. Par exemple, le fs-source la plus courante utilisée pour l'imagerie sont accordable Ti: saphir lasers. Alternativement, d'autres lasers ultrarapides peuvent être utilisés, par exemple l'erbium ion 17, chrome forstérite 18 ou Ti: saphir pompé infrarouges oscillateurs paramétriques optiques. Le microscope peut être équipée d'un objectif avec de préférence une ouverture numérique relativement élevée. Très important, avant les mesures, et à chaque fois que l'objectif est remplacé, il est impératif de réduire au minimum la dispersion présente dans la configuration (lentilles) en optimisant les paramètres de l'impulsion laser de pré-compresseur au travaillongueur d'onde de choix. Ce procédé, décrit dans le protocole, en sorte que l'impulsion laser soit aussi proche que possible de la transformer durée limitée (c'est à dire la plus courte que possible) dans le plan focal et à optimiser la réponse de l'échantillon non linéaire.
L'objectif de l'analyse d'image décrite à la fin du protocole est d'identifier et de suivre les mouvements en 3D HNPs associés aux contractions rythmiques de battre grappes cardiaques. Nanoparticules de suivi dans le plan de l'image est tout simplement réalisé en identifiant leurs positions dans des images vidéo successives. Pour extraire des informations sur le déplacement axial, un étalonnage préalable de la réponse non linéaire de l'intensité en fonction du déplacement axial est obligatoire. Notez que pour les mesures à long terme, un contrôle interférométrique actif de la position axiale de l'échantillon est nécessaire pour maintenir la validité de la courbe d'étalonnage en présence de dérives thermiques et / ou mécaniques.
Les HNPs utilisés ici pour traccellules e battant dans les agrégats sont basés sur l'oxyde de potassium de niobate (KNbO 3), mais d'autres nanomatériaux non linéaires disponibles sont examinés en détail dans l'ouvrage de Staedler et al 16.
Les rendements optiques non linéaires de la plupart des nanomatériaux étudiés à ce jour sont très comparables. Le choix de KNbO 3 est essentiellement motivé par la bonne stabilité de la solution colloïdale et sa bonne biocompatibilité, testé sur plusieurs lignées de cellules humaines, même à concentration relativement élevée et des temps d'exposition longs 16.
Compte tenu de la nouveauté du nanomatériau utilisé pour ce travail, les principales caractéristiques de HNPs que par rapport à / luminescents bio-marqueurs fluorescents sont présentés dans une animation vidéo de l'ordinateur d'origine à court réalisé par les auteurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'application de la nanotechnologie à la recherche de cellule souche est relativement nouveau mais en pleine expansion domaine. Comme le souligne divers articles de revue sur le sujet, l'utilisation de nanoparticules peut être appliqué pour accomplir des tâches de recherche différents, allant de la cellule de suivi (à la fois in vitro et in vivo), pour la délivrance intracellulaire de protéines et de gènes, notamment la création d' environnements cellulaires biomimétiques pour la stimulat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le financement partiel du projet de recherche du 7e PC NAMDIATREAM européenne (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) et le projet INTERREG IV France-Suisse NAOMI.
Materials
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37°C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | CFI Plan Fluor 10x | NA 0.30, WD 16 mm |
| CFI Plan Apo 20x | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40x | NA 1.25, WD 0.18mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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