Konsensus Brain-derived protein, Extraction protokoll för studier av humana och murina Brain Proteome Använda Både 2D-DIGE och Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Ett vanligt proteinutvinning protokoll med hjälp av urea / tiourea / SDS-buffert för människa och mus hjärnvävnad möjliggör identifikation av proteiner genom 2D-DIGE och deras efterföljande karakterisering av mini 2DE immunoblotting. Denna metod gör det möjligt att få mer reproducerbara och tillförlitliga resultat från humana biopsier och experimentella modeller.

Abstract

Två-dimensionell gelelektrofores (2DE) är ett kraftfullt verktyg för att avslöja proteome ändringar potentiellt relaterade till olika fysiologiska eller patologiska tillstånd. I grund och botten är denna teknik bygger på separation av proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkt i ett första steg och för det andra i enlighet med deras molekylvikter med SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). I den här rapporten en optimerad provberedningsprotokoll för liten mängd humant efter slakt och mus hjärnvävnad beskrivs. Denna metod gör det möjligt att utföra både tvådimensionella fluorescens skillnad gelelektrofores (2D-DIGE) och mini 2DE immunoblotting. Kombinationen av dessa metoder gör att man kan inte bara hitta nya proteiner och / eller protein ändringar i sina uttryck, tack vare dess förenlighet med massdetektering spektrometri, men också en ny insikt markörer validering. Således, mini-2DE kopplad till västra läsk tillstånd för att identifiera och validera inläggetTranslationella modifieringar, proteiner katabolism och ger en kvalitativ jämförelse mellan olika förhållanden och / eller behandlingar. Häri, tillhandahåller vi en metod för att studera komponenterna i proteinaggregat som finns i AD och Lewy body demens, såsom amyloid-beta-peptiden och den alfa-synuklein. Vår metod kan således anpassas för att analysera proteomet och olösliga proteiner extrakt från human hjärnvävnad och musmodeller också. Samtidigt kan det ge användbar information för studier av molekylära och cellulära involverade i neurodegenerativa sjukdomar samt potentiella nya biomarkörer och terapeutiska mål.

Introduction

Psykiska och neurologiska sjukdomar utgör 13% av den globala sjukdomsbördan, måste nya utmaningar som patofysiologiska mekanismer, riskfaktorer och prodromal biomarkörer utforskas ^1. I linje med detta mål, proteomik studier av den mänskliga hjärnan blivit oumbärlig för att avslöja molekylära vägar som är inblandade i processer som minne, beteende, känslor och neuronal plasticitet till exempel, inte bara för fysiologisk utan också för patologiska tillstånd. Därför är användning av djurmodeller och mer specifikt transgena möss, ger en mängd möjligheter att härma etiologin av humana neurodegenerativa störningar ^2.

Proteomik metoder är numera tillgängliga för att uppnå dessa nya perspektiv inom neurovetenskap fältet. Tvådimensionell gelelektrofores (2DE) är en potent och sannolikt enkel metod som gör det möjligt att jämföra proteomet av ett brett spektrum av prov. Dessutom är det också enkraftfull metod för att isolera ett protein från en komplex blandning i syfte att identifiera och ytterligare analysera genom masspektrometri. Denna teknik består i huvudsak i två på varandra följande steg: 1) proteinseparation i enlighet med deras isoelektriska punkt (pl) av isoelectrofocusing (lEF). Mer exakt, är en elektrisk potential appliceras över remsor på Immobiline akrylamid bland en pH-gradient och sedan proteiner kommer att migrera och fokusera på en bestämd pl i funktion av deras globala nettoladdning. 2) isoelektriskt fokuserade proteiner denatureras och negativt laddad genom tillsättning av natriumdodecylsulfat (SDS), och därigenom proteiner i deras första strukturen separeras beroende på deras skenbara molekylvikt (MW) genom SDS-PAGE ^3. Dessa två distinkta egenskaper tillåter oss att ta itu med ett dubbelt värde att gå vidare i studien av proteomet. Å ena sidan ger denna metod möjlighet att utföra en kvantitativ analys med minimala färgämnen 2D-DIGE metoden, och å andra sidan en qualitative analys av mini-2DE kopplad till western blotting.

Kvantitativ analys av 2D-DIGE skänker proteinuttryck förändras hela prov proteome. I korthet är prover märkta med tre cyaniner (CY2, Cy3 och Cy5) avger vid tre olika våglängder (blått, grönt och rött). Dessa fluor minimala färgämnen, som innehåller N-hydroxi succinimidylester grupp reagerar med ε-aminogruppen i lysin-rester i proteiner som resulterar i kovalenta amidbindningar ^4. Lysinresterna märks endast mellan 1-3% och därmed förhindra flera etiketter tillägg per protein och stora nettoladdnings ändringar ^{5, 6.} Cy3 och Cy5 används ofta för att märka två oberoende urval medan Cy2 taggar en blandning av lika delar av proverna att jämföra. De två främsta fördelarna är att alla märkta proverna blandas och IEF och SDS-PAGE utförs i en gel på en gång för varje steg, undvika bland variationsrikedomen bland experiment på grund av geler jämförelse. Dessutom har den en hög tröskel på cirka 1 femtomol protein ⁷ upptäckt. Gel skannas och 2D-programvara jämför 2D gel fluorescens bilder, där Cy2 fungerar som en inre standard möjliggör identifiering av statistiska skillnader mellan platserna för deras bakre identifiering av masspektrometri. 2D-analys programvara med hjälp av intern standard uppnår en snabb upptäckt av mindre än 10% av skillnaderna mellan prover med mer än 95% av statistisk konfidens ^8.

Kvalitativ analys av mini-2DE är ett avgörande steg för proteinkarakterisering. Principen är densamma som tidigare beskrivits för pl och MW-separation, men i detta fall proteiner överförs från ett litet polyakrylamidgel till ett membran och immunoblotting utföres efteråt. Medan en dimension gelelektrofores ger förändringar i proteinuttryck för ett eller flera protein epitoper i funktion av den antikroppen, INFORMATIOn mini-2DE förser med ytterligare två parametrar. För det första de protein isovariants förändras som funktion av pl, vilket anger att posttranslationella modifieringar kan äga rum. För det andra kan samlas identifiering spektrometri tyda på rimliga zymogener och katabola produkter av proteiner. , Modifieringar observeras av 2D-DIGE är därför sannolikt ett tecken på de mekanismer som ligger bakom förändringarna i den globala proteome profilen. Anpassningar av immunoblots bland flera prover för samma protein epitop / s genom mini-2DE kan återspegla surhetsgraden förändringar sprider ljus i post-translationella variationer lätt observeras eller ens genom monodimensional immunoblottning ^{9, 10.} Dessutom informerar denna analys om de potentiella klyvningsställen på grund av kunskapen om pl och MW de metaboliska rester ^11,12.

Kombinationen av dessa två tekniker ger en komplementär proteomik analys. Å ena sidan 2D-DIGE ger en type av skillnader som möjliggör en exakt isolering av polypeptider vars uttryck är olika. Dessa skillnader består i huvudsak i utseende eller försvinnandet av en plats eller ökning / minskning av intensiteten i en viss en och programvara analys av fluorescerande geler. Emellertid är dessa observationer i sig är osannolikt att förklara vilket slag av modifiering observerades. Av dessa skäl, när polypeptiden isoleras och identifieras med masspektrometri, användning av mini-2DE gör det möjligt att exakt bekräfta 1) identiteten av proteinet isoleras och 2) vilken typ av skillnad: förändring av isovariant / isoform nivå uttryck, post-translationella modifieringar och klyvningsprocesser till exempel. Det är dock nödvändigt att utveckla en startlyseringsbuffert både kompatibel med 2D-DIGE och med mini-2DE för att begränsa de potentiella dispersioner följd av användningen av utvinningsprotokoll som är mycket olika.

I denna artikel har vi debeskrivs ett anpassat protokoll för beredning, utvinning och prestanda för 2D-DIGE och mini-2DE tekniker för hjärnproteiner som kommer från människa och mus vävnad.

Protocol

1. Homogenisering och Total Protein Extraction från Human och mus hjärnvävnad Hjärnvävnad homogenisering. Homogenihjärnvävnaden 10% (vikt / volym) i 8 M urea, 2 M tiokarbamid och 1% vikt / volym SDS-buffert (UTS) med användning av en Potter-glas (för prover från människa) eller Teflon-homogenisator (till möss proven). Sonikera vid 60 Hz 30 pulser med en ultraljudsgenerator ansöker 0,5 sek för total vävnad sönderfall 13, 14. Bestäm proteinkoncentrationen med Bradford-analys…

Representative Results

Proteomics på hjärnvävnad fortfarande utmanande eftersom ingen idealisk buffert finns för att återvinna 100% av proteiner, speciellt membran-associerade eller cytoskeleton proteiner. Den första uppsättningen av experiment fokuserade på sökandet efter en lämplig lyseringsbuffert kompatibel med de två metoderna och som gör det möjligt att återvinna en stor panel av protein. Således var tre lys buffertar analyseras för att bestämma den mest lämpliga. För det första var det används den vanliga biokemisk…

Discussion

Upptäcka patologiska uttrycket ändras av proteiner, söka efter biomarkörer och modulering av potentiella vägar för farmakologiska mål är bland målen för de neuroproteomics närmar sig ^30. Mitt i de framväxande verktyg, det 2DE fältet lägger en lovande expectative. Icke desto mindre bör ett samförstånd nås för att minimera variabilitet och öka reproducerbarheten i experimenten. I linje med denna idé ett standardiserat protokoll för att utföra 2D-DIGE (figur 2) och den eft…

Materials

CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5