Konsensus Brain-protein, Extraction protokollen for Studiet af humane og murine Brain Proteome Brug både 2D-DIGE og Mini 2DE Immunoblotting

Summary

En almindelig proteinekstraktion protokol hjælp urea / thiourinstof / SDS buffer for mennesker og mus hjernevæv tillader Identifikation af proteiner ved 2D-DIGE og deres efterfølgende karakterisering af mini 2DE immunoblotting. Denne metode gør det muligt at opnå mere reproducerbare og pålidelige resultater fra humane biopsier og eksperimentelle modeller.

Abstract

To-dimensional gelelektroforese (2DE) er et kraftfuldt værktøj til at afdække proteommønstrene modifikationer potentielt relateret til forskellige fysiologiske eller patologiske tilstande. Dybest set er denne teknik er baseret på adskillelse af proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt i et første trin, og for det andet efter deres molekylvægte ved SDS polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). I denne rapport en optimeret prøveforberedelse protokol for lille mængde af menneskelig post mortem og mus hjernevæv er beskrevet. Denne metode gør det muligt at udføre både todimensional fluorescens forskel gelelektroforese (2D-DIGE) og mini 2DE immunoblotting. Kombinationen af ​​disse metoder gør det muligt ikke kun at finde nye proteiner og / eller protein modifikationer i deres udtryk, takket være dens forenelighed med massespektrometri detektion, men også en ny indsigt i markører validering. Således mini-2DE koblet til Western blotting tilladelser til at identificere og validere indlæg-Translationelle modifikationer, proteiner katabolisme og giver en kvalitativ sammenligning mellem forskellige forhold og / eller behandlinger. Heri giver vi en metode til at studere dele af protein aggregater fundet i AD og Lewy body demens, såsom amyloid-beta-peptid og alfa-synuclein. Vores metode kan således tilpasses til analyse af proteomet og uopløselige proteiner ekstrakt fra humane hjernevæv og musemodeller også. Parallelt hermed kan det give nyttige oplysninger for studiet af molekylære og cellulære pathways involveret i neurodegenerative sygdomme samt potentielle nye biomarkører og terapeutiske mål.

Introduction

Mentale og neurologiske lidelser udgør 13% af den globale sygdomsbyrde skal nye udfordringer som patofysiologiske mekanismer, risikofaktorer og prodromal biomarkører blive udforsket ^1. I overensstemmelse med denne målsætning proteomics undersøgelser af den menneskelige hjerne, blevet uundværlige til at afdække molekylære veje involveret i processer som hukommelse, adfærd, følelser og neuronal plasticitet for eksempel, ikke kun for fysiologisk, men også for patologiske tilstande. Derfor er brugen af dyremodeller og mere specifikt den transgene mus, bringer en bred vifte af muligheder for at efterligne ætiologien af humane neurodegenerative sygdomme ^2.

Proteomics metoder er i dag til rådighed for at nå disse nye perspektiver i neurovidenskab felt. To-dimensionel gelelektroforese (2DE) er en potent og sandsynligvis simpel metode, som gør det muligt at sammenligne proteom af en bred vifte af prøver. Desuden er det også enkraftfuld metode til at isolere et protein fra en kompleks blanding med henblik på at identificere og foretage yderligere analyser ved massespektrometri. Denne teknik består i det væsentlige i to på hinanden følgende trin: 1)-protein separation i henhold til deres isoelektriske punkt (pI) ved isoelektrofokusering (IEF). Mere præcist er en elektrisk spænding anvendes på tværs immobilin acrylamid strips blandt en pH-gradient og derefter proteiner vil migrere og fokusere på en bestemt pI i funktion af deres globale net ladning. 2) Isoelectrically fokuserede proteiner denatureres og negativt ladede ved tilsætning af natriumdodecylsulfat (SDS), derved proteiner i deres første struktur adskilles afhængig af deres tilsyneladende molekylvægt (MW) ved SDS-PAGE ^3. Disse to distinkte egenskaber tillade os at tackle en dobbelt værdi at gå videre i studiet af proteom. På den ene side har denne fremgangsmåde giver mulighed for at foretage en kvantitativ analyse ved hjælp af minimal farvestoffer 2D-DIGE metode, og på den anden side en Qualitative analyse af mini-2DE koblet til western blotting.

Kvantitativ analyse af 2D-DIGE skænker protein udtryk ændrer hele prøven proteomet. Kort fortalt prøver mærket med tre cyaniner (Cy2, Cy3 og Cy5) udsender ved tre forskellige bølgelængder (blå, grøn og rød). Disse fluor minimale farvestoffer indeholdende N-hydroxy-succinimidylester gruppe reagerer med ε-aminogruppen af lysiner rester af proteiner resulterer i covalente amidbindinger ^4. Lysinaminosyrer mærkes kun mellem 1-3% og dermed forhindre flere etiketter tillæg pr protein og større netto charge modifikationer ^{5, 6.} Cy3 og Cy5 bruges ofte til at mærke to uafhængige stikprøver, mens Cy2 tags en blanding af lige andel af prøverne til sammenligningen. De to væsentligste fordele er, at alle mærkede prøver blandes og IEF og SDS-PAGE udføres i en gel på én gang for hvert trin, så man undgår den inter variation blandt eksperimenter grund gels sammenligning. Endvidere frembyder en høj tærskel opdagelse på omkring 1 femtomole af protein ^7. Geler scannet og 2D software sammenligner 2D gel fluorescens billeder, hvor Cy2 tjener som en intern standard, der giver mulighed for identifikation af statistiske forskelle mellem de spots for deres bageste identifikation ved massespektrometri. 2D analyse software ved hjælp af intern standard opnår en hurtig detektering af mindre end 10% af forskelle mellem prøver med mere end 95% af statistisk tillid ^8..

Kvalitativ analyse af mini-2DE er et afgørende skridt for protein karakterisering. Princippet er det samme som tidligere beskrevet for pI-og MW-separation, men i dette tilfælde proteiner overføres fra en lille polyacrylamidgel til en membran og immunoblotting udføres bagefter. Mens den ene dimension gelelektroforese giver ændringer i proteinekspression for en eller flere proteinepitoper i funktion af antistoffet den INFORMATIOn af mini-2DE forlener med to ekstra parametre. For det første ændrer protein isovariants som funktion af pI, hvilket indikerer, at post-translationelle modifikationer kan finde sted. For det andet kan massespektrometri identifikation være tegn på plausible zymogener og kataboliske produkter af proteiner. Derfor ændringer observeret af 2D-DIGE er sandsynligvis tegn på mekanismerne bag ændringer i den globale proteom profil. Opstillinger af immunoblots blandt flere prøver for det samme protein epitop / s af mini-2DE kan afspejle surhedsgraden ændringer kaste lys ind i post-translationelle variationer lidt observerede eller endda ikke ved monodimensional immunblotting ^{9, 10.} Desuden er denne analyse informerer om de potentielle spaltningssteder på grund af kendskabet til PI og MW af de metaboliske rester ^11,12.

Kombinationen af ​​disse to teknikker giver en supplerende proteomics analyse. På den ene side 2D-DIGE giver en type forskelle giver mulighed for en præcis isolation af polypeptider, hvis udtryk er anderledes. Disse forskelle består hovedsagelig i udseende eller forsvinden af ​​en plet eller forøgelse / reduktion af intensiteten af ​​en given én efter software-analyse af de fluorescerende geler. Er imidlertid usandsynligt, at forklare arten af ​​ændringen observeret disse observationer af sig selv. Af disse grunde, når polypeptidet er isoleret og identificeret ved massespektrometri, anvendelse af mini-2DE muligt præcist at bekræfte 1) identiteten af ​​proteinet isoleres og 2) arten af ​​forskellen: ændring i isovariant / isoform niveau udtryk, post-translationelle modifikationer og spaltningsprodukter processer f.eks. Det er imidlertid nødvendigt at udvikle en begyndende lysisbuffer foreneligt med 2D-DIGE og med mini-2DE med henblik på at begrænse de potentielle dispersioner som følge af anvendelse af ekstraktionsmidler, protokoller, der er meget forskellige.

I denne artikel, vi bevet en tilpasset protokol til forberedelse, udvinding og ydeevne 2D-DIGE og mini-2DE teknikker til hjernens proteiner, der kommer fra mennesker og mus væv.

Protocol

1.. Homogenisering og Total protein Udsugning fra mennesker og mus Brain Tissue Hjernevæv homogenisering. Homogenisere hjernevæv 10% (w / v) i 8 M urinstof, 2 M thiourinstof og 1% vægt / vol SDS puffer (UTS) ved hjælp af en Potter glas (for humane prøver) eller Teflon-homogenisator (for mus prøver). Soniker ved 60 Hz 30 pulser med en ultralyd generator anvender 0,5 sek for total væv disintegration 13, 14. Bestem proteinkoncentration med Bradford assay, ved hjælp af BSA som standard…

Representative Results

Proteomics på hjernevæv forbliver udfordrende, da nogen ideel buffer eksisterer for at genvinde 100% af proteiner, især membran-associeret eller cytoskeleton proteiner. Det første sæt eksperimenter blev fokuseret på søgning efter en egnet lyseringspuffer forenelig med de to tilgange og som gør det muligt at gendanne et stort panel af protein. Således blev tre lysis buffere analyseres for at bestemme den mest hensigtsmæssige. For det første blev det brugt fælles biokemisk og molekylærbiologisk buffer Tris-HC…

Discussion

Opdage patologiske udtryk ændringer af proteiner, søge efter biomarkører og modulering af potentielle veje for farmakologiske mål er blandt målene for de neuroproteomics nærmer ^30. Midt i de nye redskaber, den 2DE felt tilføjer en lovende expectative. Alligevel bør konsensus nås med henblik på at minimere variabilitet og øge reproducerbarhed i eksperimenterne. I tråd med denne idé en standardiseret protokol for at udføre 2D-DIGE (figur 2) og den efterfølgende 2DE immunoblotting…

Materials

CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5