Kvantifisering av Breast Cancer Cell Invasivitet Ved hjelp av en tredimensjonal (3D) modell
Summary
Denne artikkel gir detaljerte metoder for anvendelse av tre-dimensjonale (3D) analyser for å kvantifisere brystkreft celle invasjon. Nærmere bestemt diskuteres de prosedyrer som kreves for å sette opp slike analyser, kvantifisering og data-analyse, så vel som fremgangsmåter for å undersøke tap av membranintegritet som oppstår når cellene invadere.
Abstract
Det er nå godt kjent at mobilnettet og vev mikromiljøet er kritiske regulatorer som påvirker startfasen og progresjon. Videre har den ekstracellulære matriks (ECM) blitt demonstrert å være en viktig regulator av celle oppførsel i kultur og homeostase in vivo. Den nåværende metode for dyrking av celler på to-dimensjonal (2D), plast-overflater resulterer i forstyrrelser og tap av komplekse interaksjoner mellom celler og deres mikromiljø. Ved bruk av tre-dimensjonale (3D) kulturanalyser, blir betingelsene for celle-mikromiljøet interaksjonen etablert ligner in vivo mikromiljøet. Denne artikkelen gir en detaljert metode for å dyrke brystkreft celler i en 3D basalmembran protein matrix, eksemplifiserer potensialet i 3D-kultur i vurderingen av celle invasjon i det omkringliggende miljøet. I tillegg diskuterer vi hvordan disse 3D-analyser har potensial til å undersøke tapet av signale Molecmodulene som regulerer epithelial morfologi ved farging prosedyrer. Disse studiene hjelpemiddel for å identifisere viktige mekanistiske detaljer i prosessene som regulerer invasjon, som kreves for spredning av brystkreft.
Introduction
Migrasjon og invasjon av individuelle eller kollektive celler er to kjennetegnene ved kreft, og kreves for metastatisk spredning av kreftceller 1-4. Muligheten av kreftceller til å initiere metastasering avhenger av deres evne til å migrere og invadere i den nærliggende vev ved hjelp av invadopodia å nedbryter basalmembranen til cellene. Invadopodia er dynamiske aktin rike matriksdegradering utstikkere som muliggjør nedbrytning av ekstracellulære matrise gjennom utgivelsen av matrix-nedverdigende proteaser fem. Cancer celle invasjon involverer nedbrytning av matriksen etterfulgt av vandring av kreftcellene, og dette er ledsaget av en omstilling av tre-dimensjonale (3D) miljø matrise 2.. Således, for å trenge gjennom grunnmassen, må en celle omdanne formen og samhandle med den ekstracellulære matriks (ECM) 2.
Vedlikeholdet av brystvev integritet avhenger av tett controlled vevsarkitektur siden celle-ECM og celle-celle adhesjon veikryss påvirke genuttrykk og forstyrrelse av epitel polaritet kan føre til utbruddet av kreft 6-10. Men de fleste in vitro migrasjon og invasjon analyser som Transwell kammer analyser eller sår-skrape analysene er to-dimensjonale (2D) og dermed disse forsømmer de intrikate samspillet mellom celler og deres tilstøtende miljø 3,6,8,11-14. Betydelige morfologiske og funksjonelle forskjeller inkludert variasjoner i mobilnettet morfologi, cellulær differensiering, celle-matrix voksninger og genutrykksmønster har blitt oppdaget ved dyrking celler i 3D kulturer som ofte mangler i 2D-analysene 2,6,8,11. Dermed bruker av 3D-analyser er betydelig gunstig i rekapitulere en mer fysiologisk in vivo tilstand, som fører til en bedre oversettelse av banebrytende funn i grunnforskning til klinikken 6-10. Imidlertid bør det bemerkes, Til tross for de mange fordeler oppnådd ved bruk av 3D-kulturer, kan denne modellen ikke fange opp alle av kompleksiteten av in vivo-tumormikromiljøet som inneholder forskjellige celletyper. Imidlertid er det mulig å innlemme stromale celler i 3D modellene (for eksempel fibroblaster, leukocytter og makrofager) for å studere virkningen av tumor-stromal interaksjoner på cancer celle adhesjon og invasjon 15-17.
Bryst epiteliale celler i kultur vokser mest effektivt når ECM-proteiner slik som laminin og kollagen er til stede. Med denne kjente, har et kommersielt tilgjengelig matriseblandingen er avledet fra Engelbreth-Holm-sverm (HMS) murine tumor og er kjent som Matrigel basalmembran matrise 2,8. Det er etablert en rekke teknikker for å vokse epitelceller som 3D-kolonier i kjelleren membran matrise 2,8. Den 3D basalmembran matrise modellen er effektivt for å etablere både ondartede og ikke-ondartede brystcellevekst, som likner det som forekommer i in vivo miljø 18,19. MCF10A celler er ikke-maligne mammary epitelceller. Når dyrket i basalmembran matrise, disse cellene utstillings in vivo egenskaper av normale brystceller og gjennomgår kontrollert celleproliferasjon, cellepolarisering, og apoptose for å etablere lumen plass 8,12,20. Videre utseendet på cellekjerner av MCF10A celler danner acini i 3D kulturer nærmere likne de av mammary epitelceller i vev enn de som dyrkes i monolayer 21. Studier av bissell og medarbeidere var de første til å vise at ondartede brystcellene kan skilles fra ikke-maligne bryst celler når de dyrkes i et laminin rike omgivelser, siden de ondartede cellene viser en svært uorganisert fenotype, økt proliferasjon, nedsatt celle-til- celleadhesjon, økt ekspresjon av mesenchymale markører og en økning i antall invasive struktur dannet 3,6,22.
Abnormiteter i cellemiljøet kan påvirke tumordannelse 20. Den 3D kulturmetode kan brukes for effektivt å studere kommunikasjon som oppstår mellom tumorceller og deres omkringliggende miljø, og bestemme hvor protein expression påvirkninger slik kommunikasjon 14,20,21,23. Denne artikkel gir en detaljert metode for å dyrke MDA-MB-231 bryst-kreftceller i 3D-kulturer for å analysere invasivitet og for å studere tap av epithelial morfologi ved hjelp av en epitelial markør laminin, en komponent av cellen basalmembran 18,19,24, 25. Den detaljerte fremgangsmåter gjør det mulig å nøyaktig og reproduserbart kvantifisere stel (invasiv) struktur dannelse av noen invasive kreftcelle, og er ikke begrenset til de vanlige brystcancercellelinjer (for eksempel MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, eller T47D ). Således kan denne analysen tjene som en plattform for å vurdere hvor protein ekspresjon i celler eller behandling med pro-og anti-invasive forbindelser regulere ekstracellulære matrise degradering, av én eller flere celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utviklingen av 3D cellekultur teknikker har tillatt forskere å studere transformasjonen av bryst epitelceller, slik at vi kan visualisere dramatiske morfologiske endringer. Foruten å analysere celle invasjon, kan de enkelt-eller flercellede mammary epiteliale sfæroider brukes til å vurdere endringer i cellulær adhesjon, spredning, størrelse, og basal-apikal polaritet. I motsetning til tidligere rapporterte metoder hvor cellene er kledde med ECM 8, bygger vår metode cellene i ECM 18,19,24, no…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
