フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。
人工ナノ粒子は、治療および診断目的のために非常に有望な特性に恵まれている。この作品は、免疫細胞とナノ粒子の相互作用を研究するためのフローサイトメトリーによる分析の高速で信頼性の高い方法を説明している。一次免疫細胞が容易に、抗体媒介性の磁気単離によって、ヒトまたはマウス組織から精製することができる。最初のインスタンスにおいて、フローサイトメーターで実行して異なる細胞集団は、内部の複雑さをセルに関連するセルサイズに比例する前方散乱光(FSC)および側方散乱光(SSC)によって識別することができる。さらに、特定の細胞表面受容体に対する蛍光標識抗体は、同じサンプル内のいくつかの亜集団の同定を可能にする。細胞は、それらの生理学的および形態学的状態を変化させる外部刺激によって後押しされたとき、多くの場合、これらすべての機能が異なります。ここで、50nmのFITC-SiO 2のナノ粒子は、目を識別するためのモデルとして使用されているヒトの血液の免疫細胞内のナノ構造材料の電子の内在化。ナノ粒子とのインキュベーション後の細胞蛍光及び側方散乱光の増加は、私たちは、ナノ粒子 – 細胞相互作用の時間および濃度依存性を定義できる。さらに、そのようなプロトコルは、具体的には、単球/マクロファージ系統に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する変異マウスから単離された中枢神経系の常在免疫細胞を、初代ミクログリアによるローダミンのSiO 2ナノ粒子の相互作用を調査するために拡張することができる。最後に、細胞へのナノ粒子の内部移行に関連するデータフローサイトメトリー、共焦点顕微鏡によって確認されている。
工業ナノ材料は、最近の生物医学1への潜在的なアプリケーションのための生命科学者の関心を鼓舞している。無機および有機材料の多種多様な異なる形状、物理的および化学的特徴を有するナノ構造体を製造するために使用することができる。これらの構造の中では、球状の人工ナノ粒子は、診断および翻訳の薬2のための大きな可能性を示した。それらのコアと表面設計が可能アプリケーションによって駆動され、それは、ナノ粒子の接触および相互作用を、以下の標的細胞応答の深遠な研究を意味する。意図的にヒト対象に投与されると考えられているナノ粒子は、免疫細胞のいくつかのタイプと直接接触するであろう。身体の整合性を維持するために彼らの責任は彼らナノメディシン3中の調査の重要な話題になります。
先天性免疫系の細胞性部分は、主に食作用によって表されるcytes。これらの中でも、中枢神経系常駐ミクログリアを含む、単球/マクロファージ系統由来の細胞は、免疫防御4,5において重要な役割を果たす。彼らは外国の団体と遭遇した後、数時間以内に防御反応を誘発することができます。さらに、単球細胞は、サイトカインの放出を介して適応免疫応答を調整し、指示する。すべてのこれらのイベントでも、主に免疫系6によって「非自己」と認識されている設計の材料の存在下で起こる。
歴史的に、細胞免疫学分析のために用いられる方法の中で、最も強力なツールのうちの1つを表すフローサイトメトリー。さらに、特定の免疫亜集団の同定または精製のための技術の利用可能性(多くの場合、除外または1つの膜タンパク質の存在を利用する)は、その特定の一次CE上の特定のナノ粒子の効果の正確な調査を可能にするLLタイプ7。しかし、細胞は、ナノ粒子への暴露後に生理学的および形態学的変化を提示することができる。同様に、ナノ粒子が得られる結果に影響を及ぼす8、定義された波長で、光の吸収または発光のような特定の光学的パラメータを妨げることができる。だから、使用および新規材料の研究に古典の免疫学的アッセイの最終的な適応の限界が考慮されるべきである。
この作業は、フローサイトメトリーによる一次免疫細胞とナノ粒子の相互作用の検出に関する。この問題に対処するために、50nmのFITC-SiO 2のナノ粒子は、方法を説明するためのモデルとしてナノ材料を用いた。シリカ粒子は、ナノメトリックスケールで非常に正確な方法で製造することができる。例えば、電荷または疎水性などのサイズ、形状、および表面特性は、それらの生体適合性微細9を増加させるために調整することができる。のSiO 2ナノ粒子の多くの特徴は、それらをとして使用することを可能にする薬物送達のためのモデルは、粒子10。また、蛍光色素または量子ドットは、捕捉され又は画像化目的のために有用な11ナノツールを提供するこれらの粒子に結合させることができる。
実験プロトコルは、考慮すべき非常に重要な点を提示する。より高い温度およびライトがマイナスの染色歩留まりに影響を与える可能性があるので、それは、すべての染色工程中に4℃(氷上)で、おそらく暗闇の中で働くことは本当に重要です。ナノ粒子は、より良い使用直前に再懸濁されるように超音波処理することができた。
フローサイトメトリー分析の正しい流れが異なるチャネルで正しいキャリブレーションが必要です。機器のキャリブレーションは、すべての実験セッションの前に行われるべきである。計測機器に関する技術上の問題のほかにも、抗体標識に問題がある場合もあります。これは、適切な濃度での抗体を使用することが必須です。濃度が高すぎるまたは低すぎる場合には、不満シグナル強度は結果であり得る。
この手法の問題の欠点単分散サンプルでの作業の必要性、ローカライズすることができないこと信号( すなわち 、異なる細胞区画)が発生する場所。組み合わせて使用される蛍光色素の選択においていくつかの限界もある。励起および発光バンドの波長が十分にそれらの適切な測定を可能にするために分離しなければならない。使用する抗体のスペクトルが重なる場合は、正しい補正が必要となります。
フローサイトメトリーは、存在又はナノ粒子の非存在下での細胞分析のための強力な方法である。この技術は、細胞のマルチパラメトリック研究を可能にし、イベントの高い数を調査、分析の迅速性(1,000以上のセル/秒)、再現性と統計的測定値。試料は、細胞生存率を失うことなく処理することができる。
蛍光標識されたナノ粒子を用いることにより、細胞膜上に露出した特異的なマーカーによって同定される細胞亜集団において、その内在化を修飾し、定量化することが可能である。セルパラメータは、Sの存在下で変更することができます pecificナノ粒子。研究の目的に応じて、これらの変動は、比例的に増加し、ナノ粒子内在化速度と共に増加するような細胞の側方散乱のような特定の現象を同定するために使用することができる。
細胞表面のナノ粒子誘発性修飾もまた技術の限界を表すことができる。このため、細胞膜受容体の代謝回転は、常に考慮して注意する必要があり、おそらく正確に目的の細胞集団を特徴付けるために事前に知られている。ナノ粒子、オーバーロードのサンプル中の膜浸透の極端な障害は、細胞死につながることができます。
ナノ材料用量依存性の毒性を経験的に各細胞集団について試験されるべきである。明確に定義された死細胞は、蛍光定量化から除外されなければならない。例えば、アネキシンV / PI染色は、通常、壊死およびアポトーシス細胞の両方を検出するために使用されるいくつかの方法の一つである。
"> GFP発現初代細胞は、特定の細胞亜集団を選択して、前標識することなく、データを収集するための強力なツールです。補完的な蛍光ナノ粒子との組み合わせは、細胞 – ナノ粒子の相互作用の非常に高速かつ正確な定量が可能になります。薬物または遺伝子送達があると考えられている選択した組織への特定の薬物負荷を放出することができるナノ粒子を適用することにより、将来的に向上させること。医薬品の送達担体および/ または免疫モジュレーターのような特定のナノ粒子の雇用は、細胞-ナノ粒子相互作用を研究するために生物学的環境( すなわち、フローサイトメトリーを介して)の知識を必要とする。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、伊イスティトゥートイタリア語ディTecnologiaによってサポートされていました。
著者らは、この原稿のスポンサーのためにミルテニーバイオテク社(ベルギッシュグラートバハ、ドイツ)を承認したいと思い、博士パオロ·ペトルチアーニ人間軟膜を提供するための(免疫血液学および輸血サービス、病院ロッティポンテデーラ、ピサ、イタリアの部)と教授マッシモPasqualetti(生物学科 – 細胞のユニットと発生生物学、ピサ大学、ピサ、イタリア)マウスコロニーを収容するため。
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |